| 研究課題/領域番号 |
19K16254
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
阿部 崇志 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (70756824)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | ショウジョウバエ / キノコ体 / γケニオン細胞 / 嗅覚記憶学習 / 2光子カルシウムイメージング / 匂い情報コーディング / 軸索コンパートメント |
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| 研究実績の概要 |
ショウジョウバエのキノコ体(MB)は忌避/報酬性の刺激と嗅覚刺激の連合学習による記憶形成の場である。MBのケニオン細胞(KCs)はγ, α'/β',α/βの3種に大別され、それぞれ記憶学習の素過程で異なる機能を有することが知られる。これらMBKCsの神経軸索は種類ごとに束状化し、各々の中でさらに接続先依存的に複数の出力領域に区画化（コンパートメント）され、固有の制御がなされ機能していると考えられている。所属研究室において、γMBKCsを転写因子CREBの発現レベル依存的に更に分離標識したGal4系統(γCRE-p, γCRE-n)が作出された。これらの系統によりラベルされる神経群は、記憶形成に必須かつ、好悪の価値情報をコードしており、忌避/報酬性のパラダイムにおいて相反的に機能する重要なサブタイプであることが行動遺伝学的に明らかにされた。
2光子顕微鏡を用いたin vivoライブイメージングにより、学習前のγCRE-p, γCRE-n KCsのそれぞれにおいて、複数の出力コンパートメントを同時に観察することで、可塑性解析の基盤となる匂い応答プロファイルを得ることを第一の目標とした。接続先のドーパミン神経（DAN）またはキノコ体出力神経（MBON）の一部を標識するLexA系統によって赤色蛍光タンパク質を共発現させた状況下で観察することで、γCRE-p, γCRE-n神経の軸索コンパートメントを正確に定義した神経活動の解析が可能となった。また、同様にLexAシステムを併用することにより、サブタイプを区別した解析が細胞体領域においても可能となった。現在、軸索コンパートメント、細胞体領域での匂い刺激による応答の記録を完了し、解析結果をまとめている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
解析の結果現在までに以下のことが明らかになった。
（1）匂い刺激による軸索領域または細胞体領域におけるカルシウムレベルの上昇パターンの比較から、異なる種類の匂いがγKC細胞群のサブタイプレベルで識別されていること。
（2）特定の匂い物質に関し、γ-CREp、γ-CREn集団としての応答性に逆の傾向が見られること。
（3）γCREp 神経においては、摂餌環境に由来する、充足あるいは飢餓といった個体における内的状態の違いにより、同一種類の匂い刺激であっても、出力領域のコンパートメント間で、応答強度の相対的関係性が変化すること。
このように記憶学習に必須なγ-CREp, γ-CREn KCsにおいて、学習前の匂い情報がカルシウムレベルの変化としてどのように表現されうるかが明らかとなってきたことから、記憶形成前後におけるプレシナプス側での可塑性検証の土台は一定程度整ったと考えた。次の段階として、顕微鏡下での嫌悪記憶の条件付け学習の際の刺激強度等の条件検討を開始した。
なお、昨年8月中旬に新型コロナウイルスに感染した。息切れ、胸部の疼痛などの後遺症と考えられる症状が継続しており、研究効率が低下している。
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| 今後の研究の推進方策 |
忌避性の連合学習においては、匂い刺激とFoot Shockが同時に入力される際にアデニル酸シクラーゼが活性化することでcAMPの産生が誘導される。その後PKAをはじめとする下流因子が活性化することでシグナル伝達がおこり、プレシナプス側での可塑的変化に寄与していると考えられている。
近年cAMPの可視化プローブとして、赤色型蛍光タンパク質センサーの PinkFlamindoが公開されたが（DOI 10.1038/s41598-017-07820-6）、本研究室の山崎によりショウジョウバエにおいてもそのUAS系統が作出、導入された。GCaMPとPinkFlamindoをγMBKCsにおいて共発現させることで、連合学習の際に同時検出器として機能するとされるキノコ体出力領域において、カルシウムとcAMPの挙動を同時に観察可能な2色イメージングの実験系を構築する。現在、プローブの至適な励起波長、強度の条件検討を完了し、顕微鏡下での忌避性刺激による条件付けのための刺激強度等の適切なパラメータも明らかになりつつある。
またこれに関連し、学習に必須とされるドーパミン受容体Dop1R1の機能欠失変異体の匂い応答様式の解析からも興味深い結果が得られている。本変異体においても条件付けを行い、その応答様式を正常個体と比較することで、学習が起こる際の神経群の活動パターンを相対的尺度で記述することを計画している。
以上を踏まえ、γMBKCsを、好悪の価値情報をコードするγ-CREp、γ-CREn KCsに分離した状態でカルシウムとcAMPの変化を同時にイメージングする。学習前、学習中、学習後の3過程を同一個体において記録観察し、出力コンパートメントにおける経時的な活動変化の様式やカルシウムとcAMP強度の相関を比較解析していく。連合学習の分子メカニズムの一端を説明しうる、動的回路図の導出を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
補助金及び基金の一部の範囲内で研究を遂行したため。
次年度も、種々の変異系統の作成、維持、継代に用いる試薬、培地を購入する。また、これらの2光子ライブイメージングによる解析のためのPC関連機器、ソフトウェア、実験器具、研究用試薬を購入する。
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