| 研究課題/領域番号 |
19K16279
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| 研究機関 | 横浜市立大学 |
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研究代表者 |
佐竹 智子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 客員研究員 (20635130)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | プルキンエ細胞 / 樹状突起 / 遺伝子改変マウス / In Utero Electroporation / アイソフォーム |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、Microtubule crosslinking factor 2 (MTCL2)のプルキンエ細胞での機能と樹状突起の形成制御の関連を明らかにし、それが正常な小脳の機能にどのように関わるのかを明らかにすることを目的としている。
初年度は、MTCL2に対する抗体を作製した。これを用いて、野生型マウス、MTCL2ノックアウトマウス、プルキンエ細胞特異的MTCL2ノックアウトマウスの小脳および大脳の抽出物のウェスタンブロットを実施した。その結果、小脳には全長MTCL2に加えて、大脳にはない複数の短いMTCL2のアイソフォームが発現していること、さらに、プルキンエ細胞特異的なアイソフォームが存在することを示す結果を得た。続いて、野生型マウス小脳cDNAから、PCRによって、全長以外の2つの短いMTCL2アイソフォームを単離した。これらは、タンパク質として発現した場合には、ウェスタンブロットで検出した短いアイソフォームの分子量に一致すると考えられた。作製した抗体を用いた小脳組織切片の免疫染色について、特異的にMTCL2を検出する実験条件の検討を行っているが、まだ不十分なため、MTCL2のプルキンエ細胞での細胞内局在の解明には至っておらず、今後の課題である。
飼育しているMTCL2ノックアウトマウスとプルキンエ細胞特異的MTCL2ノックアウトマウスには、今のところ、運動失調など小脳機能異常を示す明らかな表現型は観察されていない。今後、小脳組織切片の解析を通じて、異常の有無を検討する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
MTCL2に対する抗体を得ることができた。この抗体を用いた実験をきっかけに、MTCL2に小脳に特異的に発現するアイソフォームがmRNAとタンパク質レベルで、複数あることを見出した。そして、これらのアイソフォームの中には、プルキンエ細胞特異的なものが存在することを示す結果を得られた。
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| 今後の研究の推進方策 |
プルキンエ細胞に特異的に発現するMTCL2のアイソフォームが存在するかを調べる。そのために、野生型マウス、MTCL2ノックアウトマウス、プルキンエ細胞特異的MTCL2ノックアウトマウスの小脳からcDNAを調製し、MTCL2の各アイソフォームのmRNAの発現を比較する。
続いて、そのアイソフォームがタンパク質として発現した場合、プルキンエ細胞の樹状突起の形成に寄与するのかを調べる。そのために、In Utero Electroporation(IUE)によって、胎生期の野生型マウスのプルキンエ細胞にMTCL2のノックダウンやレスキュープラスミドを遺伝子導入し、出生後に発達する樹状突起の形態への影響を調べる。
MTCL2のアイソフォームタンパク質のプルキンエ細胞における細胞内局在を明らかにする。そのために、必要であればアイソフォーム特異的抗体を作製し、小脳組織切片の免疫染色を行う。これと並行して、タグ付きMTCL2アイソフォームを(IUE)によってプルキンエ細胞に発現させ、タグに対する抗体よる免疫染色を行い、結果を比較する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
妊娠マウスを使った実験が当初予定よりも少なく、それに伴う試薬の支出も少なかったため。また、学会参加費や旅費が不要であったため。
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