| 研究課題/領域番号 |
19K16319
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| 研究機関 | 北里大学 |
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研究代表者 |
唐木 文霞 北里大学, 薬学部, 助教 (80756057)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | スルファターゼ / ファーマコロジカルシャペロン / ライソゾーム病 / ボロン酸 / ムコ多糖症 |
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| 研究実績の概要 |
スルファターゼという酵素を構成するアミノ酸が, 本来とは別のものに置き換わると, スルファターゼが分解されやすくなることで酵素活性が損なわれ, 疾患を引き起こすことがある. 本研究の目的は, このような変異スルファターゼに結合することで, 変異スルファターゼを分解されにくくして, 酵素活性を回復させるボロン酸類を作ることである.
スルファターゼの一種であるアリールスルファターゼBの変異は, ムコ多糖症VI型という疾患の原因になる. このアリールスルファターゼBに熱をかける実験を行ったところ, 変異があるアリールスルファターゼBは, 変異がないものと比べて熱に不安定だった. さらに, アリールスルファターゼBにボロン酸類を共存させると, 変異の有無に関わらず安定性が増大した. このことから, ボロン酸類はアリールスルファターゼBに結合し, 安定化させる作用をもつと期待される. この結果を受けて, ボロン酸類が変異アリールスルファターゼBの酵素活性を回復させるか調べたが, そのような効果は認められなかった. 酵素活性を回復させるには, アリールスルファターゼBにより強く結合できるボロン酸類が必要だと考え, 現在, そのようなボロン酸類の創製に取り組んでいる.
前年度の検討結果からは, 無保護のボロン酸とジエタノールアミンを反応させることで得られるDABO boronateが, 変異スルファターゼの酵素活性を回復させる上で望ましい性質を有すると考えていた. しかし, その後の検討で, ジエタノールアミン自体が活性評価に影響した可能性が出てきたことから, 本年度は無保護のボロン酸類の合成を行った. 次年度も引き続きボロン酸類の合成を行い, 変異スルファターゼの酵素活性を回復させるボロン酸類の取得を目指す.
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究では, 変異スルファターゼの酵素活性を回復させる作用 (プラスの作用)とスルファターゼを阻害する作用 (マイナスの作用)を分離するために, 中性条件下でスルファターゼに強く結合し, 酸性条件下では解離するボロン酸類の創製を試みている. 前年度に得られた結果から, ボロン酸をDABO boronateの形で保護したものが, このようなpH依存的な結合能を有すると考え, 類縁体の合成を行った. しかし, のちにジエタノールアミン自体が活性を示した可能性が浮上し, 無保護のボロン酸について検討する方針へと転換を余儀なくされたことから, ここで時間的ロスがあったことは否定できない. それでも, 種々の置換基を有する, 無保護のボロン酸類を合成し, 活性を評価することはできている.
さらに, 当初計画した通りに, ボロン酸類が変異スルファターゼの酵素活性を回復させる作用についても, 検討をはじめることができた. 現時点で酵素活性を回復させるボロン酸類は見出せていないが, 今後も引き続き検討を進めることで, 見出せる可能性があると考えている.
以上の2点に関する進捗を踏まえ, (2) おおむね順調に進展している。を選択した.
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| 今後の研究の推進方策 |
スルファターゼに対する結合能は, 阻害能と相関すると考えられる. 結合能よりも阻害能のほうが容易に評価できることから, 本研究ではpH依存的にスルファターゼを阻害するボロン酸類の探索を行っている. 無保護のフェニルボロン酸類を合成し, アリールスルファターゼBに対する阻害作用を調べた結果, オルト位にアルコキシ基を有するボロン酸類にやや強い作用が認められた. この構造をもとに, さらにフェニルボロン酸類を設計・合成し, 強い阻害作用を有するボロン酸類の創製を目指す.
次に, 上で創製したボロン酸類が, 変異アリールスルファターゼBに対して及ぼす作用の検討を行う. 具体的には, ボロン酸類で処理することにより, 変異アリールスルファターゼBの酵素活性が回復するか調べる. さらに, ウエスタンブロット法を用いれば, 安定性が低い未成熟なスルファターゼと, 十分に安定な成熟体のスルファターゼを, 別々のバンドとして検出することができる. このことを利用して, ボロン酸類を作用させた場合に, 未成熟体の比率が減少し, 成熟体の比率が増大するかについても調べる予定である.
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究を計画した当初は, ウエスタンブロット法による未成熟体および成熟体の発現量の検討と免疫染色法による細胞内での局在の調査を, 2020年度に開始する予定としていた. しかし, 実際にはボロン酸類の合成に注力したため, これらの検討はまだ行っていない. そのため, ウエスタンブロット法および免疫染色法に必要な試薬・消耗品類を購入せず, 次年度使用が生じた. これらの検討については2021年度に行うこととし, 予算についても2021年度のものと合わせて使用する.
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