| 研究課題/領域番号 |
19K16338
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| 研究機関 | 岐阜薬科大学 |
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研究代表者 |
中山 辰史 岐阜薬科大学, 薬学部, 講師 (50433206)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 電気化学 / スーパーオキサイド / 酸化 / 非プロトン性溶媒 / タンパク質凝集 / アルキルアンモニウム塩 / 排除体積効果 / 含硫タンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
当該年度は、電気化学測定・電解ESR測定・分光測定を中心に、タンパク質、構成アミノ酸のスーパーオキサイド（Superoxide Anion Radical;SAR）による酸化を検証した。酸化的電子移動解析には、非プロトン性溶媒中（N,N-dimethylformamide）での電気化学測定（Cyclic Voltammetry法）を用い、スーパーオキサイド－アミノ酸・タンパク質間の電子移動を解析した。SARは、酸素の一電子電極還元により生成させ、タンパク質を共存させた際の電流電圧曲線の変化により反応を観察した。その結果、以下の二点の問題が生じ、詳細を解析している。
①含硫アミノ酸を有するタンパク質において、他のアミノ酸残基に見られない電流変化を観測した。この結果は、スーパーオキサイドとタンパク質内の硫黄元素の反応が、硫黄特異的なSS結合と関係して進行したことを示唆している。この反応では、スーパーオキサイドによる硫黄元素の酸化的電子移動が、硫黄元素のπ軌道上にスピンが非局在化する場合と、3d軌道上に局在化する場合で、まったく異なる後続電子移動・結合の形成が進行する様子を示した。これらは、含硫タンパク質の活性酸素種による酸化が、硫黄元素酸化時の分子軌道の違いによって様々に変化し、特にタンパク質立体構造維持に必須のS-S結合・S-N結合を制御すると推察される。
②タンパク質の溶解度が、電気化学測定における支持電解質に大きく影響を受けることが明らかとなった。そのため、電解質による溶解度変化を差し引いて検証する必要があることが分かり、溶解度・タンパク質アンフォールディングに対応するαヘリックス構造の変化を観測した。この結果は、タンパク質の溶解度が電気化学測定で採用されるバルキーな電解質の排除体積効果に大きく影響を受けることを示唆した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
電気化学手法では、金属の電極表面（10nm 程）に発生する電気二重層が電場となって 酸化反応が進行する。この測定環境を実現するために、充分な量の支持電解質を加えて測定することが一般的であり、有機溶媒にはバルキーな支持電解質（Tetrabuthylammonium perchlorate;TBAP、Tetrapropylammonium perchlorate;TPAPなど）を加えるため、溶媒中で大きな体積を占め、タンパク質の溶解度と立体構造に大きな影響を与えてしまう。この問題を解決するため、支持電解質による排除体積効果を見積もり、タンパク質の酸化時に計測される電流電圧曲線から、電解質の不要な効果（排除体積効果）を差し引いて観測する方法を検証した。
また検証・開発した手法を用いて、タンパク質内部のSARによる酸化を観測したところ、電極表面で生成するSARがタンパク質内部を酸化し、ヘリックス構造（立体構造）の破綻以外に、フラグメント化・βシート化による凝集も引き起こすことが明らかとなった。これらの変化のうち、特にタンパク質内のジスルフィド結合（SS結合）をターゲットとした酸化反応が関与する立体構造変化が推察され、硫黄原子の酸化状態が各種結合に直接関与することが示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
電極での酸素の一電子還元によって生成したSARによる間接酸化について、電子移動直後のタンパク質のコンフォーメーション変化を観測し、立体構造変化と酸化的電子移動の相関性を更に解析する。その際に、電気化学測定時に利用する有機溶媒用支持電解質（TBAP）の効果（脂溶性、排除体積効果）を差し引いて評価し、SARによる酸化の実態を明らかとする。
また、特にタンパク質のアンフォールディング（αヘリックス構造の破綻）と、βシート構造の形成について、それぞれ円二色偏光（CD）スペクトル、Coomassie Brilliant Blue R-250（CBB）染色を用いた蛍光測定により、酸化後のタンパク質の状態を観測することで、タンパク質構造中の酸化ターゲット部位を予測する。
併せて、モデリング計算により上記酸化反応を解析する。量子科学的な反応予測（反応経路解析、軌道エネルギー計算）については、反応全体を計算解析することは難しいため、まずは非断熱的（垂直型）電子移動 により生成する含硫タンパク質（該当アミノ酸周囲）の酸化ラジカルの軌道エネルギー・自由エネルギーを算出する。酸化によるラジカルの形成が、後続する分子内SS結合の再形成・分解に寄与する可能性について、コンフォー メーション変化と反応経路についてスペクトル解析の結果と比較し検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ計画通りに支出しており、来年度予算と併せて使用する計画です。
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