| 研究課題/領域番号 |
19K16359
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| 研究機関 | 昭和薬科大学 |
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研究代表者 |
鎌田 祥太郎 昭和薬科大学, 薬学部, 特任助教 (10823932)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | X線結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
今年度は、内在性アミノ酸がPPARAのどこに結合し、どのように阻害するかを明らかにするために、X線結晶構造解析を行うためのCorepressor共存下の結晶作成と、このタンパク質に結合して目的結晶の精製を阻害する大腸菌由来脂肪酸を除いたhPPARA-LBDの精製を目標に研究を行った。
研究はおおむね順調に進んでおり、Corepressor共存下の結晶作成では様々な条件検討の結果100マイクロメートル程度の大きさの結晶を再現良く作成することに成功した。この結晶を放射光施設にて測定した結果、分解能は最高で3.0オングストローム程度であった。内在性アミノ酸の結合確認にはより高い分解能が望ましく、より高い分解能を目指して結晶化条件やクライオ条件の検討を行っている。
大腸菌由来脂肪酸を除いたタンパク質の作成では、有機溶媒による脱脂・リフォールディングを行った結果、脱脂したタンパク質を得た。現在このタンパク質が適切にリフォールディングされているか活性を確認している。問題ないことを確認しCorepressor共存下の結晶作成に利用する。X線結晶構造解析により内在性アミノ酸の結合が確認出来次第、結合に重要なアミノ酸残基の点変体を作成し、アンタゴニスト活性に変化があるか調べて、研究目標を達成する。つくばフォトンファクトリーは春の運転は中止となり、9月まで放射光施設での測定はできなくなってしまったが、新型の小型X線回折計を利用することで遅滞なく研究を進めていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
Corepressor共存下の結晶作成では、初めに微量分注装置モスキートを用いて、多数の結晶化沈澱剤条件を検討した。1,000種程度の沈澱剤条件を4度と20度のそれぞれの条件下で試し、その結果複数の条件下で結晶が得られた。このうち大きな結晶が得られたいくつかの条件で結晶化をおこなったところ、100マイクロメートル程度の大きさの結晶を再現良く作成することに成功した。放射光施設にてこの結晶を測定した結果、分解能は最高で3.0オングストローム程度であった。以前報告のあるPDB ID: 1KKQと同じ空間群でありCorepressorの結合が確認できた。内在性アミノ酸の結合確認にはより高い分解能が望ましいため、より高い分解能を目指して条件検討を行っている。
大腸菌由来脂肪酸を除いたタンパク質の作成では、まずグアニジン変性や透析により脂肪酸が除けるか確認したが、除くことはできなかった。そこで次は有機溶媒による脱脂を試みた。その結果、脱脂することはできたがタンパク質が沈澱するため、グアニジンに再溶解することとした。グアニジンを除き、適切にリフォールディングさせるため、段階的に透析を行ったがタンパク質が沈澱してしまった。意外にも希釈によりグアニジン濃度を下げることで、沈澱がより少なくなったため、この条件を用いることにして、大腸菌由来脂肪酸を除いたタンパク質を得た。現在このタンパク質が適切にリフォールディングされているか活性を確認している。
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| 今後の研究の推進方策 |
Corepressor共存下の結晶作成では、より高い分解能を目指して結晶化条件やクライオ条件の検討を行っている。現在の結晶化条件に近いものだけでなく、まんべんなく結晶化を行い、また結晶の形が異なるような条件も検討する。結晶のサイズは大きいものがとれているため、見た目による判断ではなく、小型X線回折計により分解能を測定する。2.5オングストローム程度かそれより高い分解能を目指している。より良い結晶が得られれば、放射光施設よる測定を行う。構造が得られれば、その結合部位のうち結合に重要なアミノ酸残基の点変体を作成し、アンタゴニスト活性に変化があるか調べる。
大腸菌由来脂肪酸を除いたタンパク質の作成では、有機溶媒による脱脂・リフォールディングを行ったタンパク質の活性を確認している。同時に共結晶化条件の分かっているアゴニストでも結晶化を行い、結晶化に使用可能なタンパク質か、また構造は変わっていないか確認する。問題ないことが確認できればCorepressor共存下の結晶作成に利用する。問題があれば有機溶媒を別のものに変更することや、リフォールディング条件を検討し直すことにより、再度検討する。
つくばフォトンファクトリーは春の運転は中止となり、9月までは放射光施設よる測定はできなくなってしまった。しかし、昨年末に本学に導入されたハイブリッド型多次元ピクセル検出器により、測定感度や速度が大幅に向上し、クオリティの高いデータを撮ることができるようになっている。この小型X線回折計を利用することで遅滞なく研究を進めていく。
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