| 研究課題/領域番号 |
19K16366
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| 研究機関 | 国立医薬品食品衛生研究所 |
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研究代表者 |
林 克彦 国立医薬品食品衛生研究所, 衛生微生物部, 研究員 (60804739)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | マイコプラズマ |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、培養細胞に持続的に汚染するマイコプラズマの検出及び感染機構の解析を目的として、細胞培養の培地成分または培地上方気相成分（臭気成分）のメタボローム解析を試みている。メタボローム解析の結果から、マイコプラズマに特徴的な代謝産物から汚染の検出を試み、また持続的な汚染に関わる生理的因子及び関連遺伝子を探索する予定である。モデル細胞として、抗体産生に広く利用されるCHO DG44細胞を、陽性対照のマイコプラズマ種として、第十七改正日本薬局方参考情報に収載のアコレプラズマ及びマイコプラズマ 計7種を研究に用いている。
1年目では、マイコプラズマ汚染モデル細胞の調製及び検証を行い、汚染モデル細胞の培地成分のメタボローム解析を実施した。CHO DG44細胞に陽性対照のマイコプラズマ 7菌種を接種し、CHO DG44細胞の細胞数推移、CHO DG44細胞の生存率及びマイコプラズマのコロニー形成単位（CFU）の推移を4日間測定した。陽性対照のマイコプラズマ 7菌種を300～30,000 CFU/mLで接種すると、CHO DG44細胞の細胞数及び生存率に影響はなかったが、Mycoplasma pneumoniae以外の6菌種でマイコプラズマの増加が認められた。菌数が増加したマイコプラズマ種のうち、Acholeplasma laidlawiiは、CHO DG44細胞の存在に非依存的に増殖した。CHO DG44細胞存在下でのみ増殖し、かつ増殖が顕著だったMycoplasma hyorhinis汚染モデル細胞の培養上清に対して、C18カラム及び質量分析装置OrbitrapでLC-MS解析を行うと、培地成分のフェニルアラニンが検出された。マススペクトルからは、汚染モデル細胞と陰性対照間に有意差がなかったことから、代謝産物の検出感度を上昇させる必要性が示された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
本研究は、3年間を予定している。1及び2年目では、CHO DG44細胞を用いたマイコプラズマ汚染モデル細胞を作製し、培地成分または培地上方の臭気成分から、特徴的な代謝産物を検出することで、検出を試みることを予定している。現在までに、CHO DG44細胞を用いたマイコプラズマ汚染モデル細胞の調製法を確立した。試験に用いたマイコプラズマ種のうち、Mycoplasma pneumoniae以外では、CHO DG44細胞と共存して増殖することを明らかとし、Acholeplasma laidlawii、Mycoplasma arginini、Mycoplasma fermentans、Mycoplasma hyorhinis、Mycoplasma orale及びMycoplasma salivariumの汚染モデルを確立した。A. laidlawiiでは、CHO DG44細胞に依存せず、培地のみの条件でも細菌数が増加した。これ以降の実験において、細菌数の増加がCHO DG44細胞の存在に依存し、かつ最も増殖が顕著だったM. hyorhinis汚染モデル細胞を陽性対照として用いることとした。M. hyorhinis汚染モデル細胞の培養上清をアセトニトリルで除タンパクし、C18カラム及び質量分析装置Orbitrap LC-MSで解析を行うと、MS/MS解析によってフェニルアラニンと同定されるマススペクトルのピークを検出した。これ以外の顕著なマススペクトルのピークが検出されなかったことから、検出感度を上げる必要性が示唆された。検出感度を上昇させるため、マイコプラズマに特徴的な代謝産物の抽出、精製及び濃縮を計画し、精製に係る試薬及び分析用カラムを選定した。
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| 今後の研究の推進方策 |
1年目の研究によって、質量分析装置によるメタボローム解析を通じたマイコプラズマ検出では、代謝産物の検出感度を上げる必要性が示唆された。メタボローム解析で対象となる代謝産物としては、アミノ酸、糖質、脂質及び小分子が挙げられる。検出感度を上昇させるには、目的の代謝産物の濃度を上昇させることが求められ、代謝産物の種類に合わせた抽出法及び精製法によって、濃縮が達成できると考える。
今後の研究方策としては、マイコプラズマ汚染モデル細胞及びその培養上清から、アミノ酸、糖質及び脂質を抽出して精製し、メタボローム解析を行う。特に、マイコプラズマの脂質に注目して解析を行う。マイコプラズマには他のグラム陽性細菌と異なり、細胞壁及びリポ多糖（LPS）が欠如した特徴的な形質膜が存在し、また、Mycoplasma salivariumでは脂質成分がLPSを含まないにも拘らず発熱性物質として機能することが知られていることから、マイコプラズマは特徴的な脂質分子を保有していると考えられる。
アミノ酸及び糖質の解析では、固相カラムによる精製及びトリメチルシリル誘導体化を行い、GC-MSによるメタボローム解析を計画している。脂質の解析では、Bligh-Dyer変法によって総脂質を抽出し、LC-MSを用いたリピドミクス解析を計画している。培地の臭気成分の解析では、回収量を増加させるため、培養上清にシリカゲル担体による臭気成分吸着剤を浸漬して回収する。アミノ酸、糖質及び脂質のメタボローム解析によって、質量分析装置によるマイコプラズマの検出感度を評価し、臭気成分のメタボローム解析によるマイコプラズマの検出感度と比較して、検出手法の評価を行う。
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