| 研究課題/領域番号 |
19K16447
|
|---|
| 研究機関 | 広島大学 |
|---|
研究代表者 |
川見 昌史 広島大学, 医系科学研究科(薬), 助教 (20725775)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 上皮間葉転換 / 薬剤性肺障害 / 抗がん剤 / 肺胞上皮 / メトトレキサート |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究では、薬剤性肺障害の原因として考えられている肺胞上皮から間葉系細胞への形質転換である上皮間葉転換（EMT）について、特に抗がん剤によるEMT誘発機構の解明を試みる。
2019年度では、抗がん剤によって誘発されるEMTに特異的な機構を解明するため、これまで当研究室でEMT誘発の実績があるメトトレキサート（MTX）を用いて、MTXによってEMTが誘発される細胞と誘発されない細胞の分取およびそれらの安定的な維持培養法の確立を試行した。
MTXを肺胞上皮細胞モデルであるA549細胞に暴露後、次に示す２種類の手法で、EMT細胞および非EMT細胞の分取法の確立を試みた。①限界希釈法によってA549細胞から、形質が均一であるクローン細胞を取得し、MTXによるEMTへの感受性が高いクローンと低いクローンへ分類する、②セルソーターを用いて、MTXによって有意に変動するEMTマーカー（細胞膜表面に局在するタンパク質、細胞の形態）を指標に、EMT細胞および非EMT細胞を分取する
①については、クローン自体の安定的な形質の維持培養が困難であったが、MTXによる細胞死とEMTのプロセスがそれぞれ独立する可能性を示す知見を、それぞれのクローンから得た統計解析から見出した。また、②については、細胞膜表面タンパク質としてインテグリンα2サブユニットがMTXによって有意に上昇することを明らかにし、現在当該タンパク質に着目した分取法の確立を進めているところである。また、細胞の形態（大きさ、細胞内構造）の特徴によって細胞を分取して解析を行ったが、MTXによって形態が変動した細胞であっても、その形態が変動しなかった細胞と比べて特にEMTマーカーで変動するといった事象は認められなかった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
2019年度にEMT細胞と非EMT細胞の分取法の確立を行う予定であったが、クローン細胞を用いたアプローチでは困難であったこと、および細胞膜表面に存在する有用なEMTマーカータンパク質の探索に時間を要したことから、分取法の確立には至らなかった。現在は、インテグリンα2サブユニットに着目した分取法の条件確立を進めており、条件確立後、速やかにEMT細胞および非EMT細胞の分取に取り組む予定である。
|
| 今後の研究の推進方策 |
現在MTXによって発現が上昇し、細胞表面に局在するEMTマーカータンパク質を用いて、セルソーターによるEMT細胞および非EMT細胞の分取法の条件検討を進めている。これら条件を確立後、分取した細胞のtotal RNAをreal-time PCR法によって解析し、EMTの代表的なマーカー遺伝子であるα-SMAなどの遺伝子発現が期待通りに変動したことを確認後、それらサンプルをRNAseqによってさらに解析し、EMTおよび非EMT細胞における網羅的な遺伝子発現変動について比較解析を行う。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
セルソーターを用いたEMTおよび非EMT細胞の分取法のためのマーカータンパク質の探索に時間を要したため、それら条件の確立に費やす予定であった費用が未使用となった。現在は、インテグリンα2サブユニットに着目した分取法の確立を目指して検討を行っており、条件確立後は、当初の予定であったEMT細胞および非EMT細胞における網羅的な遺伝子変動の比較検討に進む予定である。
|
