| 研究課題/領域番号 |
19K16451
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| 研究機関 | 横浜薬科大学 |
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研究代表者 |
矢野 健太郎 横浜薬科大学, 薬学部, 講師 (40644290)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 濾胞性リンパ腫 / P-gp / 機能調節因子 / 悪性化 / 薬物耐性 / ドキソルビシ / ビンクリスチン / 排出系トランスポーター |
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| 研究実績の概要 |
再発時の濾胞性リンパ腫の治療が奏効しないのは、継続的な抗がん薬治療によって薬物耐性能が亢進することが原因であると仮説を立て、薬物耐性化モデル細胞を作出に着手した。方法としては、抗がん薬であるドキソルビシン（Dox）、またはビンクリスチン（Vinc）を濾胞性リンパ腫に細胞に持続暴露し、薬物感受性試験により薬物耐性能を評価した。薬物耐性因子としては、DoxやVincなどの抗がん薬を細胞外へ掃き出すP-糖タンパク質（P-gp）の機能変化に着目した。現在、Dox 50 nMの単独持続暴露細胞の増殖が確認され、耐性能を評価中である。Vinc 1nMを単独持続暴露した細胞においては、Vincに対する耐性が明らかに（少なくとも10倍）亢進していた。ただし、高濃度（1 μM）のVincを用いても、耐性指標である50%生存率（IC50）を算出することができなかったため感受性試験の時間延長などを含め検討中である。一方、明らかな耐性亢進が認められたことから、P-gpの輸送機能を評価したところ、P-gpの輸送機能の亢進傾向が認められた。また、各種遺伝子発現量の変化を確認したところ、P-gpの遺伝子発現量には有意な増加は認められなかった。したがって、P-gpの発現増加に依存しない機能亢進メカニズムが存在するものと考えられ、追加試験を実施中である。加えて、がん薬物耐性における排出系トランスポーターの関与について、これまで得られた知見をまとめた。（Cancers. 12(11):3352. 20210.）さらに、がん細胞の浸潤・転移能を亢進させると、P-gpと同様に薬物耐性に関わる多剤耐性タンパク (MRPs) は機能が亢進することを見出した。このとき興味深いことに、乳がん耐性タンパク (BCRP) は機能が低下した。（Biol Pharm Bull. 44(1):103-111. 2021.）
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2020年度は、「リンパ腫の薬物耐性化モデルの構築と P-gp の機能評価」および「P-gpの機能亢進メカニズムの検討」を推進すべく各種検討を行った。まずリンパ腫の薬物耐性化モデルの作製としては、P-gpの基質であり、濾胞性リンパ腫の治療に用いられるDoxやVincを持続暴露した。Vinc 1 nMを持続暴露は、Vincに対する薬物耐性能を誘導することが確認された。そこでP-gp基質薬物であるrhodamine123（Rho123）の細胞内蓄積量を評価したところ、未処理の細胞と比較して持続暴露細胞においてRho123の蓄積低下が確認された。また、この低下はP-gp阻害薬であるVerapamilにより消失した。従って、Vinc持続暴露細胞のP-gpは排出機能が上昇しており、これにより細胞の薬物耐性能が亢進したものと考えられた。次に各種遺伝子発現量を測定したところ、P-gpのmRNA発現量に変化は認められなかった一方で、他の細胞でP-gpの膜上発現および輸送機能を調節することが確認されているezrinの発現が、顕著に低下していた。ゆえに、本研究におけるP-gpの輸送機能亢進は、これまでに知られている膜上発現亢進以外のメカニズムが関与していることが考えられた。なお上記と並行して、DoxとVincとの併用持続曝露を開始した。Dox 10 nM+Vinc 1 nMを持続暴露した細胞において、Doxに対する耐性の亢進は認められなかったものの、Vincに対しては耐性が亢進していることが確認された。さらに耐性が亢進したモデルを構築すべく持続暴露を継続しているところである。以上のことから、濾胞性リンパ腫の薬物耐性モデルは樹立しつつあり、耐性モデルにおいてP-gpの輸送機能亢進の確認およびそのメカニズム解析に着手できていることから、研究計画はおおむね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
当初の計画通り、薬物持続曝露細胞で認められたP-gp の輸送機能亢進にERMタンパクが関わっているかを、siRNAを用いた遺伝子発現抑制実験により明らかにする。結果としてE、R、Mいずれかのタンパクの関与が認められた場合、メカニズムとしてそのタンパクがP-gpの膜上発現変動を誘導したかを評価する。また、輸送機能に最も影響のあるERMタンパクを抑制したとき、薬物を持続曝露したリンパ腫細胞の薬物耐性亢進も抑制可能であるかを、ドキソルビシンを用いた細胞毒性試験により評価する。これにより、薬物持続曝露時のP-gpの機能上昇およびこれに起因した薬物耐性亢進には、特定のERMタンパクの抑制が有用であるかを明らかにできるものと考えられる。なお、既に遺伝子発現の抑制等の実験条件の探索には着手している。これまでの結果から、毒性が低いながらもmRNAの発現抑制効果が認められる条件が整ってきているが、タンパク質レベルでの低下が認められるより顕著な抑制効果が得られる方法を見出すべく検討を重ねている。一方で、mRNA発現量の解析結果からは、ERMタンパクが関与していない可能性も考えられるため、並行してWestern blottingあるいは免疫蛍光染色法などを利用した細胞膜上のP-gp発現量が変動しているかを確認していく。ここまでの検討により薬物耐性化の現象とその直接的な原因となる下流のメカニズムを明らかにする。また、より根本的な治療を想定して、薬物耐性化を誘導する上流因子を探索する。本研究では、悪性化誘導因子として知られているmiRNAに着目し、細胞が分泌する微小小胞（エクソソーム）内の miRNA を網羅的に解析することで、耐性株において増加している miRNA を絞り込む。さらに、絞り込まれた miRNA を培養中の非耐性株に添加し、悪性化が誘導されるかをこれまでと同様の検討にて評価していく。
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