2019 年度実施状況報告書

侵害受容C線維の刺激特異性を決める遺伝子の探索とlabeled line説の検証

研究課題

研究課題/領域番号	19K16480
研究機関	奈良県立医科大学
研究代表者	石西綾美奈良県立医科大学, 医学部, 研究員 (10836018)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2022-03-31
キーワード	疼痛 / labeled line
研究実績の概要	痛みは身体の異常を感知して警告信号を発信する重要な役割を果たす。しかし、痛みは様々な疾病においてQOLを著しく低下させる因子でもある。疼痛の発生メカニズム及び神経系における伝達機構は多様でありその全貌は明らかではない。我々は、別の研究テーマで使用しているBACトランスジェニックマウス（以下、TGマウス）が、痛み刺激に対する反応が著しく低下していることを偶然に発見した。興味深い点は、機械刺激および化学刺激に対する反応は著しく低下しているものの、熱刺激に対する反応は正常であることである。我々が見出した表現型は多様な刺激に反応すると考えられていたC線維が、実は明確なグループに区別できることを示唆する。これまでにも、異なる痛み刺激は異なる末梢神経を活性化させる可能性も考えられてきたが（labeled line説）、その証明には至っていない。本研究は、極端な疼痛鈍麻マウスの順遺伝学的解析で疼痛原因遺伝子の同定とそれに基づくlabeled line説の検証を行うことを目的とした。 TGマウスはBACトランスジーンの挿入によって、その領域の内在性の遺伝子の発現を阻害または変動させ、その結果生じる遺伝子の機能異常により、疼痛刺激に対する行動変化が起きたと仮説を立てた。次世代シークエンスを用いた順遺伝学的なスクリーニングにより、トランスジーン挿入部位近傍の3つ遺伝子制御が完全に破綻していることを見出した。本研究では、同定された候補因子の中で細胞膜の動態や細胞内トラフィッキングに関与する因子、Sorting nexin (Snx)に着目した。現在までにSnx-KOマウスはTGマウス同様に痛み行動の減弱と免疫系細胞の異常が認められることを見出している。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 TGマウスはBACトランスジーンの挿入によって、その領域の内在性の遺伝子の発現を阻害または変動させ、その結果生じる遺伝子の機能異常により、疼痛刺激に対する行動変化が起きたと考えた。次世代シークエンスを用いた順遺伝学的なスクリーニングにより、トランスジーン挿入部位近傍の3つ遺伝子制御が完全に破綻していることを見出している。本研究では、同定された候補因子の中で細胞膜の動態や細胞内トラフィッキングに関与する因子、Sorting nexin (Snx)に着目した。Snx-KOマウスを入手して行動試験を含む様々な検討を行った結果、TGマウス同様に痛み行動の減弱と免疫系細胞の異常が認められた。また、WTおよびSnx-KOマウスからDRGニューロンを調整し、Ca　imagingを行なった結果、Snx-KOマウス由来のDRGニューロンでは発痛物質に対する反応が有意に減弱していることを見出した。さらに、疼痛発生時に機能が亢進する疼痛関連因子(TRPV1, Nav1.7, P2X3, Trk等)の発現を調べた結果、Snx-KOマウスではDRGにおけるこれらの発現が著しく低下していることを見出した。興味深いことに、Snx-KOマウスもTGマウスと同様に機械刺激および化学刺激に対する反応は著しく低下しているものの、熱刺激に対する反応は正常であった。
今後の研究の推進方策	これまで用いているTGマウス、Snx-KOマウスと入手予定のKOマウスを用いて、同定遺伝子の欠損がなぜ機械刺激と化学刺激誘発性疼痛行動を抑えるのかについて解析する。これらのマウスでは一次求心性線維における活動電位や脊髄へのシナプス入力が変化している可能性があるため、DRGにおける活動電位伝導および脊髄後角におけるC線維誘導性興奮性シナプス後電流を電気生理学手法で記録する。また、標的遺伝子のコンストラクトを用いた過剰発現系やsiRNAを用いた発現抑制系でDRGニューロンまたはHEK293細胞の細胞内Ca+濃度、相互作用因子、下流シグナル解析をCa imaging、質量分析、免疫沈降法で明らかにする。また、TGマウスを用いた遺伝子発現網羅解析により、野生型マウスと比較してTGマウスで発現量が大きく変動する遺伝子を40個同定している。これらの遺伝子について野生型マウスのC線維、後根神経節(DRG)およびC線維の終止する脊髄後角における発現をin situハイブリダイゼーション、免疫組織化学手法で明らかにした上でSnxとこれらの遺伝子がどのように関与しているのかを明らかにしていく。

研究成果

(1件)

すべて学会発表 (1件)

[学会発表] 「痛覚鈍麻マウスの順遺伝学スクリーニングによる新規疼痛候補遺伝子の同定」2019
- 著者名/発表者名
  田中達英、奥田洋明、寺田雄紀、新城武明、西村和也、石西綾美、竹村晶子、辰巳晃子、和中明生
- 学会等名
  Neuro2019（新潟）