| 研究課題/領域番号 |
19K16491
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| 研究機関 | 大分大学 |
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研究代表者 |
粂 慎一郎 大分大学, 医学部, 助教 (90794579)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | イオンチャネル / hERGチャネル / 構造機能連関 / 分子生物学 / 電気生理学 |
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| 研究実績の概要 |
電位作動性カリウムチャネルファミリーに属するhERGチャネルは、電位センサードメイン（VSD）とポアドメイン（PD）が同じサブユニット間で相互作用するという、同ファミリーでは見られない独自の構造（Non-domain swapped構造）をとり、VSDとPDを細胞内で繋ぐS4-S5リンカードメイン（S4S5LD）とC末端細胞内のCリンカードメイン（CLD）との間に、この構造的特徴に伴う独自の相互作用が存在する。このS4S5LDとCLDとの間で形成される相互作用は、hERGチャネルの特徴的な遅い脱活性化の制御機構への関与が示唆され、本研究はその構造機能連関の解明を目的とする。
本研究では、このS4S5LDとDLDとの間の相互作用に焦点を当て、①相互作用に最も重要な部位（アミノ酸ペア）はどこか、②相互作用部位がチャネルの開閉状態に依存して構造変化するか、また、③遅い脱活性化の制御機構におけるこの相互作用の役割は何かを明らかにするべく、パッチクランプ法による膜電位固定下でのシステイン（Cys）架橋形成実験を主とした分子生物学的・電気生理学的な実験・解析を計画している。
本年度までに、上述の①～③の実験・解析に使用する予定の各種変異体の作製に取り組み、準備が完了したサンプルに対しての実験・解析を順次行ってきた。しかし、「現在までの進捗状況」にて後述するように、年度途中でパッチクランプ法に使用している顕微鏡セットに故障が生じたため、新しい実験機器の購入やその後のセットアップなどを行っており、本研究計画の完了には至らなかった。そのため、次年度への期間の再延長申請を行った。その他、本研究計画の実験方法等を応用することにより、hERGチャネルや他のチャネルにおける薬剤への影響に関する実験・解析も実施しており、これらの結果に関しては、論文による発表や学術大会での発表に至っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究では、hERGチャネルの遅い脱活性化に関する構造機能連関の解明を目指し、特徴的なNon-domain swapped構造に伴う独自のS4S5LD-CLD間相互作用に焦点を当て、「研究実績の概要」で上述した①～③の解析を計画している。
前年度では、①と②の実験・解析に移行するための準備のため、各種の実験・解析に使用する各種変異体を作製し、それらの変異体を使用するための最適な実験条件の検討等を行っていたが、前年度の時点で申請時の研究実施計画よりも遅れが生じていた。本年度はその続きから実験・解析を開始し、これまでに①と②に関するいくつかの結果を得ることができた。また、③の解析も行う予定であったが、年度途中でパッチクランプ法に使用している顕微鏡セットに故障が生じたため、新しい機器の購入やその後のセットアップなどを行った。それにより、実験・解析を一時的に中止していた期間があり、①～③のいずれの実験・解析でも、それ以上の解析を行うことができず、完了には至っていない。
以上のように、実験機器の故障による影響のため申請時の実験実施計画から遅れが生じている。また、新型コロナウイルス感染症への対策としての対面授業の中止に伴う授業動画の作製など、当年度の数ヶ月間は持続的に実験を行えない状態が続いた。以上のような理由から、本研究における現在までの進捗状況は、申請時の研究実施計画から遅れていると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は、申請時の研究実施計画では、当年度で完了の予定であった。しかし、「現在までの進捗状況」にて上述したように、本研究の進捗状況は当初の計画よりも遅れてしまっており、次年度への期間の再延長申請を行う形となった。それに伴い、次年度も本研究を継続する予定である。
本研究は今後とも、hERGチャネル独自のS4S5LD-CLD間相互作用に焦点を当て、「研究実績の概要」で上述した、①相互作用に最も重要な部位（アミノ酸ペア）はどこか、②相互作用部位がチャネルの開閉状態に依存して構造変化するか、また、③遅い脱活性化の制御機構におけるこの相互作用の役割は何かを明らかにし、このチャネルの遅い脱活性化に関する構造機能連関の解明を目指す。本年度までに、①～③の実験・解析での使用を予定している各種変異体等の準備は行っており、また、故障が生じた実験機器に関しての修理および調整は完了している。そのため、次年度では残っている①～③の実験・解析を完了させるべく、本研究の遂行に向け尽力したい。また、得られた結果をまとめ、論文としての発表、または学術大会での発表を考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた主な理由としては、「現在までの進捗状況」で上述したように、本研究における現在までの進捗状況が申請時の研究実施計画から遅れていることが挙げられる。当年度では、「研究実績の概要」で記載した①～③の実験・解析が、「現在までの進捗状況」で上述した理由から中断してしまっていたため、それらの実験・解析において使用する予定であった物品・試薬等の購入に至らなかった。また、学術大会へ参加するための旅費として考えていた額については、コロナ禍の影響による学術大会のオンライン開催への移行に伴い、本年度中に使用することができなかった。以上のような理由により期間の再延長申請を行ったため、次年度使用額が生じる結果となった。
ここで生じた次年度使用額に関しては、研究実施計画に基づき、中断していた今後の実験・解析のための試薬の購入等に使用する予定である。また、コロナ禍の収束により学術大会の会場での開催が可能になった際の旅費、および、論文として発表する場合はその費用として使用する予定である。
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