| 研究課題/領域番号 |
19K16521
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
細羽 康介 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 助教 (20781264)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | in vitro試験 / 固形癌誘発 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題では所属する研究室が新たに開発した転写調節システムであるTREE（three-component repurposed technology for enhanced expression)システムを用いてマウスに誘発した固形癌の転移能や浸潤能を制御することを目的としている。当該年度ではマウスに移植する癌細胞の選別を行った。その結果、in vitroで得られている知見をもとに移植に用いる細胞株を決定した。また、予備実験として、マウスに固形癌を誘発するための実験系の確立することを目的とした手法の習得を行うとともに、本研究課題を遂行する上で必要な培養法の確立も行った。さらに表現型解析のために必要となる研究環境の基盤を整備した。具体的にはマウスの個体の解析には組織切片の作製や、免疫染色法といった組織学的な手法が必須であるが、そのためのスキルを習得した。現在までの知見から、in vitroの実験で効果が既に確認されたことから最終年度はTREEシステムを導入した癌細胞のマウス個体内における挙動を明らかにする。今後の方針としては既にクローニング済みのTREEシステムを構成している各種タグやエフェクター分子を組み込んだAAVベクターを構築する。この際に、ヘルパーウイルスを用いないタカラバイオ社のHelper Free systemを使用する。具体的な内容としてはヌードマウス体内に癌細胞を移植することで固形癌を誘発する。その後誘発した固形癌にAAVベクターを導入し、その浸潤能や転移能における抑制効果を評価する。標的とするCDH1遺伝子の発現量はReal-time PCR法を用いて確認する。表現型の解析には習得した組織学的な手法や、3次元培養法を使用する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在までの検討で、実験に最適と考えられる癌細胞株を決定した。また、本研究で用いるTREEシステムは癌細胞で発現が低下することが知られているCDH1遺伝子を標的としているが、in vitroで高効率に癌細胞に作用し、CDH1遺伝子の発現を誘導するという知見を既に得ている。しかしながら、本研究の最終目標はマウス個体内に誘発した固形癌に対する効果を明らかにすることである。しかしながらマウスに固形癌を誘発する実験系を確立出来ておらず、未だに生体内におけるTREEシステムの有効性を実証出来ていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在までにin vitroでの知見の収集や、マウスに固形癌を誘発するための実験系の構築、そしてマウス個体の表現型を解析するための実験基盤の整備を行ってきた。最終年度では蓄積した知見をもとにマウス個体に癌細胞を移植し、固形癌の誘発を行う。癌細胞が生着し、固形癌が誘発された場合は、既にクローニングしてあるTREEシステムを構成する各ツールを組み込んだAAVベクターを構築し、マウスへの導入を試みる。遺伝子発現量に対する効果はReal-time PCRで評価する。また、表現型の解析には、確立した組織学的な手法を用いた免疫染色法を用いて癌組織への形態的な効果を実証する。さらに摘出した組織から癌細胞を抽出し、その特徴を3次元培養法を用いて明らかにする。この方法を用いることにより、癌細胞の浸潤能、転移能を定量的に明らかにすることが出来る。このように最終年度では立ち遅れているマウス個体内における固形癌の誘発から、その固形癌に対するTREEシステムの効果の実証までの内容を一貫して行うことで、本研究目的の達成を目指す。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
昨年度までは動物を用いた検討に本格的に取り組めておらず、次年度使用額が生じている。最終年度では今までに蓄積した知見をもとに、AAVベクターの構築及びヌードマウスにおける固形癌誘発を行う実験を行う必要があるため、大規模な予算執行の必要がある。
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