| 研究課題/領域番号 |
19K16525
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
松本 早紀子 大阪市立大学, 大学院医学研究科, 助教 (00789654)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 微小管 / 海馬 / 神経変性 |
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| 研究実績の概要 |
微小管は中心体を起点とした細胞骨格を形成する細胞内小器官であり、主に細胞内物質輸送のレールとして機能している。当研究室ではこれまでに、中心体に局在するSer/Thr脱リン酸化酵素Protein Phosphatase 4 catalytic subunit (PP4c) が増殖細胞において分裂間期の微小管ダイナミクスを制御することを明らかにしてきた。このことから、微小管が特に発達して存在する神経細胞においてもPP4cが微小管ダイナミクスに重要な役割を担っている可能性が推測された。そこで、生後の大脳ニューロン特異的PP4c欠損マウスを作製したところ、欠損側の海馬組織が萎縮するという表現型を発見した。本研究課題では、中枢神経系におけるPP4cの基質同定と、PP4c欠損による神経変性メカニズムを明らかにすることを目的とした。
PP4c欠損による海馬組織の萎縮のメカニズムに迫るため、PP4cの基質同定に取り掛かった。精製したGST融合PP4cリコンビナントタンパク質と、マウス海馬のタンパク抽出液を用いてPull down assayを行ない、PP4cと相互作用する蛋白質を質量分析によって解析したところ、微小管を構成するTubulinが同定された。そこで、Tubulinアミノ酸一次配列におけるPP4cによる脱リン酸化部位の特定を進めている。基質の同定と並行して、海馬神経細胞の一次培養において、PP4c欠損による表現型の探索を行った。その結果、神経細胞の形態変化と、一部の微小管結合蛋白質やシナプスマーカーの発現減少、および細胞死の促進といった現象が明らかになりつつある。今後は脱リン酸化部位の特定を急ぐとともに、リン酸化状態をmimicしたTubulinの過剰発現によってこれらの表現型の評価を行っていく。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当該年度はPP4cの基質として同定されたTubulinの脱リン酸化アミノ酸部位の同定と、PP4c欠損による海馬ニューロン一次培養の表現型探索に焦点を当てて研究を進めた。
はじめにTubulinの脱リン酸化部位の特定に関しては、当初の予定より少し時間がかかっている。その理由として、PP4c欠損マウス海馬組織からのTubulinの精製方法と、質量分析のための微量リン酸化蛋白質の濃縮方法に課題があることが考えられる。本研究では、PP4cが微小管のorganizationに関与する酵素であることから、PP4c欠損マウスからのTubulin精製では一般的な重合・脱重合による方法ではなく、イオン交換カラムや逆相カラムクロマトグラフィーなどの生化学的な方法を用いる必要がある。こうして得られたタンパク質は微量であり、夾雑物も多数含まれるため、質量分析を行うためにはリン酸化ペプチドを濃縮する必要があり、その条件検討に時間がかかっている。リン酸化部位の決定は本研究を進めるにあたって必要不可欠なステップであるため、引き続き次年度も進めていく。
これと並行して、培養細胞におけるPP4c欠損の表現型の解析を行った。これまで、海馬組織の萎縮という組織学的な表現型の検討に主に注力してきたが、細胞レベルでの詳細な解析は、PP4cの細胞内における機能を解析する上で、有用な情報となる。PP4c CKOマウス海馬ニューロンの一次培養にCreリコンビナーゼを過剰発現するレンチウィルスを感染させたところ、野生型と比べてニューライトにおけるTubulinの局在と突起の形態に変化が認められた。また、これらの細胞のウェスタンブロッティングによって、微小管関連蛋白質やシナプス特異的蛋白質の減少、さらにPP4c欠損特異的に神経細胞死が助長される傾向も少しずつ明らかになってきた。
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| 今後の研究の推進方策 |
当該年度では、PP4cの基質Tubulinのリン酸化部位特定と、培養細胞におけるPP4c欠損の表現型の探索に注力して研究を行なった。次年度では、まず遅れているリン酸化部位の特定を急ぐ。質量分析による解析は継続して行う一方、当初の計画の順序とは逆になるが、候補となるセリンおよびスレオニンに変異を入れたTubulin変異体を数種類作製し、今年度明らかになった培養細胞の表現型のレスキュー実験を行なっていく。Tubulinにはセリン・スレオニンが数多く存在するが、すでにリン酸化が報告されている部位もある。また、構造学的な知見も踏まえて候補を決定し、リン酸化mimic変異体（グルタミン酸置換）または非リン酸化変異体（アラニン置換）を用いて、PP4c欠損海馬ニューロン一次培養の表現型がレスキューされるか検討を行う。リン酸化部位の特定が済み次第、当研究室ですでに確立された方法を用いてリン酸化Tubulin特異的なモノクローナル抗体の作製を行う。野生型とPP4c欠損マウスの組織を用いた免疫組織化学やウェスタンブロッティングによって生体内のリン酸化状態を評価する。ここまでの結果をもとに、これらの研究成果を論文としてまとめ発表する準備を整える。
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