| 研究課題/領域番号 |
19K16547
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立国際医療研究センター |
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研究代表者 |
生島 芳子 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 上級研究員 (00571366)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 膵島 / 膵β細胞 / MEK/ERKシグナル / 開口放出 / 2型糖尿病 |
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| 研究実績の概要 |
本研究ではこれまでに、膵β細胞特異的Mek1/2欠損マウスの解析を通して、MEK/ERKシグナルが膵β細胞の量の制御だけでなく開口放出の制御にも寄与していることを明らかにしてきた。ERK1/2はキナーゼであることから、β細胞においてタンパクのリン酸化制御を介して開口放出を制御している可能性を考え、昨年度は膵β細胞特異的Mek1/2欠損マウス及び対照群マウスの単離膵島を用いたリン酸化プロテオミクスを施行した。これにくわえ今年度は、グルコース刺激依存的なMEK/ERK下流でのリン酸化制御を明らかにするため、膵β細胞の培養細胞株 (MIN6 clone 4 (MINcl4) 細胞) を、低濃度グルコース・高濃度グルコース刺激・MEK inhibitor存在下で高濃度グルコース刺激、の3条件で処理しリン酸化プロテオミクス解析を行った。これらのリン酸化プロテオミクスデータを用いてGO解析を施行したところ、まず、MEK/ERKシグナルが開口放出関連分子及びアクチン細胞骨格に関連する分子のリン酸化制御を介して開口放出を制御している可能性が見出された。また、膵β細胞において、細胞骨格関連分子の一部がグルコース刺激依存的にMEK/ERKシグナル下流でリン酸化制御を受けている可能性も明らかとなった。なお、インスリン分泌にアクチンフィラメントネットワークの再構成が関与していることはすでに報告がされている。
さらに、弘前大学医学部分子病態病理学講座との共同研究により、非肥満型の２型糖尿病患者と非糖尿病患者の剖検例を解析し、insulin陽性β細胞におけるpERK1/2陽性細胞の割合と切片の膵実質面積おける膵β細胞面積の割合には正の相関関係があること、また、insulin陽性β細胞におけるpERK1/2陽性細胞の割合が非肥満型の２型糖尿病患者では有意に低下していることを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度までに行った２光子顕微鏡を用いた膵β細胞の開口放出数の計測により、膵β細胞特異的Mek1/2欠損マウスの膵β細胞ではグルコース刺激及びcaged Ca2+刺激に呼応した開口放出数が低下していることが明らかとなり、MEK/ERKシグナルが膵β細胞の量の制御だけでなく開口放出の制御にも寄与していることを明らかにしてきた。そこで、開口放出を制御するメカニズムを明らかにするため、単離膵島・培養膵β細胞株を用いたリン酸化プロテオミクス解析を進めた。そして５.に記載した通り、単離膵島を用いたリン酸化プロテオミクスデータのGO解析からは、MEK/ERKシグナルが開口放出関連因子やアクチン細胞骨格関連因子のリン酸化制御を介して開口放出を制御している可能性を見出すことができた。
これに加え、既述のとおり、非肥満型の２型糖尿病患者と非糖尿病患者の剖検例の解析をすすめ、実際のヒトの２型糖尿病発症・進展と膵β細胞におけるpERK1/2たんぱくに何らかの関係性がある可能性を見出すことができた。
以上のように、膵β細胞におけるMEK/ERKシグナルの役割の検討が順調に進んでいるとともに、MEK/ERKシグナル下流でインスリン分泌を制御する候補分子の絞り込みについても進展が得られているので、概ね順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
リン酸化プロテオミクスデータを解析する中で、膵β細胞特異的Mek1/2欠損マウスの単離膵島において、controlマウスの膵島に比べリン酸化の低下している開口放出関連因子・アクチン細胞骨格関連因子のアミノ酸残基が具体的に見出されてきた。今後、MEK/ERKシグナル下流でのインスリン分泌制御に寄与している可能性のあるタンパク被リン酸化部位 (アミノ酸残基) について、これらのdataやこれまでの文献・GWASデータ等も参考にしながら、さらに絞り込みを進める。つづいて、これらのアミノ酸をアラニン置換した変異タンパクを発現するMINcl4細胞を作成し、in vitro GSISテストによってインスリン分泌能を評価する。
またRNA-seqデータから見出される、MEK/ERK下流でβ細胞増殖や開口放出を制御する候補分子についても、遺伝子欠損細胞株・アデノ関連ウイルスによるノックダウン・過剰発現・遺伝子改変マウス等を用い、その機能を解析していく。
こうした実験の結果絞り込まれる2型糖尿病の治療標的候補分子やタンパクアミノ酸残基については、その発現量やリン酸化状態を制御する薬剤を検索し、MINcl4/単離膵島への添加 (in vitro)/２型糖尿病モデルマウスへの投与 (in vivo) により、増殖能・インスリン分泌能や耐糖能への効果を評価する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
残金は51,926円で、ほぼ計画通りの支出となった。
繰越し金は培養細胞実験関連の消耗品に使用する計画である。
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