研究課題
申請者は以前、IL-17産生型gdT (gdT17) 細胞の分化にSyk依存的なTCRシグナルが不可欠であることを報告した。本研究課題では、gdT細胞におけるSykの活性化因子を同定し、gdT細胞における詳細なシグナル伝達機構の解明を目的とした。Sykの活性化にSrc family kinase(SFK)が関与すると考えられている。BlkはSFKの一つである。Blkを欠損するマウスではgdT17の分化が障害されると報告されており(Laird et al, J Immunol 2010)、BlkがSykの活性化を制御する可能性がある。申請者はCRISPR/Cas9法によってBlkを全身性に欠損するマウス(Blk KO)を作成した。Western blotによりBlkタンパク質が脾臓にて消失していることを確認した。生後１日目のBlk KOマウスの胸腺gdT細胞を解析したところ、gdT細胞の分化に大きな変化は認められなかった。また、gdTCRシグナル伝達も正常であった。さらに、PMAとイオノマイシンによってgdT細胞を刺激し、Blk欠損gdT細胞サイトカイン産生能を評価した。その結果、IFNg産生型gdT細胞およびgdT17の細胞数は野生型マウスと同等であった。これらの表現系はSyk欠損マウスとは大きく異なり、BlkがSykの活性化に関与する可能性は低いことが示唆された。
2: おおむね順調に進展している
CRISPR/cas9法を活用することで、迅速にBlk KOマウスを樹立することができた。申請者の成果から少なくともBlkはgdT細胞のシグナル伝達や分化に関与しておらず、Sykの活性化に不要であることを示している。過去の報告と申請者の結論に不一致が生じた理由として、細胞の刺激時間や刺激に用いた試薬が異なることに起因していると考えられる。
本年度の研究成果からBlkが胸腺gdT細胞の活性化に不要であることが示された。しかし、Blkは活性化した末梢gdT細胞に発現が認められ、解析の余地が残されている。また、T細胞の分化や活性化に必要なSFKの候補としてLckが挙げられる。今後、Lck KOマウスを作成し、gdT細胞の分化、活性化、機能に焦点を絞り解析を進める予定である。
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Methods in Molecular Biology
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