| 研究課題/領域番号 |
19K16611
|
|---|
| 研究機関 | 京都大学 |
|---|
研究代表者 |
佐々木 充 (本田充) 京都大学, iPS細胞研究所, 特別研究員(CPD) (60836865)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー / 患者由来人工多能性幹細胞 / 病態モデル |
|---|
| 研究実績の概要 |
本研究は、根本的治療法のない顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FSHD）について、幹細胞技術を起点として治療法提案を目指す。FSHDはDUX4遺伝子の異常発現に起因する遺伝性疾患であることは分かっている。しかし、未だ遺伝的背景から筋委縮へ至る病態メカニズムは分かっていない。特に、DUX4の遺伝子発現そのものは胎児期からすでに確認されるのに対し、実際には生後10代頃まで発症しないという、遺伝子発現と臨床像の間に大きなタイミングのずれがある。そこで本研究では、骨格筋細胞の時期特異性に着目しながら、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）を活用して、患者の臨床的特徴に直結する表現型を見出し、その分子病態を検証し、FSHD治療の分子標的を求める。まず、様々な時期に相当する筋細胞へのiPS細胞の分化誘導と、遺伝子工学を技術基盤として、病態モデルの基礎となる新たな骨格筋細胞のモデル系構築を進めた。初年度に試した、iPS細胞から骨格筋細胞への分化誘導法のうちの一つで、出生後の時期に相当する遺伝子マーカーの発現が確認され、去年度は別の健常細胞株で実験し、同様の結果が得られた。こうして得られた細胞をモデル動物の生体骨格筋に再移植することによって更なる形質転換を期待していたが、解析に十分なヒト由来細胞が得ることが難しく、別の手法の検討の必要が生じた。次に別案として、近年発表された特殊な内在遺伝子強制発現系を用いて、骨格筋前駆細胞を誘導する手法を導入すべく、ベクター構築と誘導法の最適化を行なった。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
初年度および昨年度に検討していた方法論では、発生学上の途中の段階までの分化誘導はできているデータが得られたものの、そこから次の発生学上の段階へ進むために検討すべき実験を行うにあたって、必要な細胞数が確保できないことが分かった。そのため、当該手法論はここで一旦検討を終了し、研究計画書に書いた別の方策を開始した。これにあたり、まず遺伝子編集関連のベクター構築を行い分化誘導系の基礎となるマテリアルを作製した。作製したベクターを健常者由来iPS細胞から作られた骨格筋幹細胞のマーカーPAX7 レポーター株に導入して、マーカーの蛍光シグナル陽性細胞を蛍光セルソーターで検出および純化後の遺伝子発現解析をすることで、目的の細胞種への分化誘導の是非を評価した。すると、遺伝子発現レベルでは目的因子の発現上昇が見られたが非常に生存率が低かったため、培養条件やベクター導入の条件を再度検討する必要が生じた。当初の目標としては、目的細胞の分化誘導条件を確定し、続いてFSHD患者由来iPS細胞株に適用して、表現系となる現象の検討を開始する予定であったことを踏まえると、現状の進捗はかなり遅れている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
昨年度に構築した内在遺伝子強制発現用ベクターの一部を変更することで分化誘導系の改善が見込めるため、新しいベクターの設計と構築を行う。さらに、蛍光セルソーターでの細胞純化の条件を変更することで目的の骨格筋幹細胞の集団が得られる可能性が高いことから、先述の新しいベクターの系と組み合わせて実験し、健常者由来ヒトiPS細胞株で安定的な分化誘導系を確立する。さらに、誘導した骨格筋幹細胞を成人型へ転換するための追加の遺伝子導入を検討する。具体的には、ソーティング後の細胞にエレクトロポーレーションあるいはリポフェクションで遺伝子導入するための条件検討を行ない、候補因子を導入して成人型骨格筋幹細胞のマーカーの発現と筋繊維への分化能を確認する。次に既に私たちで樹立したFSHD患者由来iPS細胞とその遺伝子修復株についてにこの誘導系を適用し、成人型への誘導への有無や、疾患・非疾患の間での比較によって、表現型の探索や病態責任因子であるDUX4の発現の動態を精査する。また、それらの現象の背景にある分子メカニズムの解明をできる限り進める。昨年度までの進捗が当初の目標よりかなり遅れていることから、今年度内で本プロジェクトの目標を全て達成することは難しいが、目標の第一目標であるヒトiPS から成人型の骨格筋幹細胞の誘導系の確立と、それによるFSHDの培養細胞系での確かな表現型の確立を最低限達成すべき目標として実験計画を進行する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
新型肺炎の状況により、出張をする機会がなかったため旅費は発生しなかった。代わりに追加の実験や解析などに必要な物品に割り当てる予定にしている。
|
