| 研究課題/領域番号 |
19K16646
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
松尾 祐一 熊本大学, 大学院生命科学研究部(保), 助教 (60802824)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 結核菌 / 低酸素適応 / エネルギー代謝 / 呼吸鎖 |
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| 研究実績の概要 |
肺結核の病原菌である結核菌は酸素分圧に応じて細胞膜に存在する呼吸鎖酵素群を使い分けることで、ATP産生に関わるエネルギー代謝経路を再構成し、多様な酸素分圧下での生存を可能とする。低酸素環境では、リンゴ酸：キノン酸化還元酵素 (MQO) と、ジヒドロオロト酸脱水素酵素 (DHODH) が発現誘導される。MQOは電子伝達系とTCA回路、及びDHODHは電子伝達系とピリミジン生合成経路に関わるように、これらの分子は複数の代謝経路で役割を果たす。本研究は、 ① 生化学的解析によりMQO、DHODHの反応機構を原子レベルで明らかとし、 ② in vivoとin vitroでの感染成立における、これら酵素群の役割を明らかにすることにより、結核菌のエネルギー代謝分子を標的とした創薬開発へ向けた基盤とすることを目的としている。
本年度は、大腸菌発現系を用いて組み換えMQO、DHODHタンパク質の生化学的解析に取り組み、 (1) 高い酵素活性を保持した組み換えDHODHタンパク質を含む大腸菌の膜画分を得た。さらに、組み換えタンパク質の可溶化条件の最適化に取り組み、(2)96ウェルプレートを用いた評価系を構築し、 (3) 組み換えDHODHの可溶化に効果的な界面活性剤を見出し、 (4) 組み換えDHODHの粗精製画分を得た。
一方、大腸菌を用いた組み換えMQOの発現に取り組み、酵素活性を保持したMQOタンパク質の発現は困難であることが分かった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
結核菌のリンゴ酸・キノン酸化還元酵素 (MQO) と、ジヒドロオロト酸脱水素酵素 (DHODH) の組み換えタンパク質を大腸菌を用いて発現させた。DHODHでは、高い酵素活性を保持した組み換えタンパク質を得ることができ、当初の計画通りに進んでいる。一方、MQOは活性を保持したタンパク質を得ることが困難であり、当初の計画からはやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
大腸菌を用いた発現系では、酵素活性を保持した組み換えMQOタンパク質が得られなかった。今後の方針は、結核菌と同属である非病原性Mycobacteriumを用いたタンパク質発現を進めることを計画している。
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