| 研究課題/領域番号 |
19K16660
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| 研究機関 | 福岡大学 |
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研究代表者 |
清水 章文 福岡大学, 医学部, 講師 (40780135)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 肺炎クラミジア / グループIIイントロン / 遺伝子改変 / プラスミドベクター |
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| 研究実績の概要 |
肺炎クラミジアにおける遺伝子破壊株ライブラリの作製を目的として、肺炎クラミジア遺伝子破壊用のプラスミドベクターの作製を行ってきた。昨年度は樹立した遺伝子破壊用プラスミドベクターの機能確認を実施するとともに、遺伝子破壊を実施する肺炎クラミジア遺伝子リストを作成してそれらの遺伝子破壊用プラスミドベクターライブラリの作製を実施する計画であった。
現在、目的とする遺伝子破壊用プラスミドベクターと遺伝子再導入用プラスミドベクターの作製が進み、目的とするプラスミドベクターの作製が完了している。そのプラスミドベクターが目的通りに機能するかについて電気穿孔法による形質導入を試みた。遺伝子破壊用プラスミドベクターについて、機能既知の肺炎クラミジア遺伝子incAを破壊する遺伝子破壊ベクターを作製し、形質転換を実施した。その際、使用する肺炎クラミジアの血清型として本研究で予定していた肺炎クラミジア血清型AR-39株ではなく血清型CWL092株を用いることとした。AR-39株は溶原化ファージを有しており、このことが形質転換への妨げとなりうると考えられたためであり、AR-39株と核ゲノムの塩基情報が一致するCWL029株へと形質転換を試みた。電気穿孔法による導入の後にクロラムフェニコールを終濃度2μg/ml加えて培養しているが、遺伝子破壊株の樹立に至っていない。また、形質導入後に得られた肺炎クラミジアの限界希釈法によるクローニングではサブクローンが樹立できていない。また、遺伝子再導入用プラスミドベクターについて、電気穿孔法による形質転換を実施しているが、薬剤選択後に肺炎クラミジアクローンが得られていない。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
昨年度までの実験によって目的とする遺伝子破壊用プラスミドベクターの構築は完了していた。遺伝子破壊後の遺伝子再導入の為に、クラミジア由来プラスミドと大腸菌プラスミドベクターとをライゲーションすることによって遺伝子再導入用プラスミドベクターの作製を実施した。
これらのプラスミドベクターが目的通りに機能するかについて、前年度の塩化カルシウム法から変更して電気穿孔法による形質導入を試みた。その際、使用する肺炎クラミジアの株として本研究で予定していた肺炎クラミジア血清型AR-39株ではなく血清型CWL092株を用いることとした。AR-39株は溶原化ファージを有しており、このことが形質転換への妨げとなりうるためであり、AR-39株と核ゲノムの塩基情報が一致するCWL029株へと形質転換を試みた。電気穿孔法による導入の後にクロラムフェニコールを終濃度2μg/ml加えて培養した。得られた肺炎クラミジア株の標的遺伝子をPCR法によって増幅したところ、野生型1,173-bp、遺伝子破壊株2,993-bpの増幅断片長が得られるところが、約600-bpから約4-kbpまでの複数の断片長が混在する煩雑な状態であった。そこで、形質導入後に得られた肺炎クラミジアの限界希釈法によるクローニングによってサブクローンの樹立を試みたが、限界希釈法の後に肺炎クラミジアサブクローンが得られなかった。
また、遺伝子再導入用プラスミドベクターについて、電気穿孔法による形質転換を実施したが、その後アンピシリンを終濃度10μg/mlで添加して培養したところ、光学顕微鏡での観察でもPCRによるDNA増幅反応でも肺炎クラミジア株を検出することはできなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
肺炎クラミジア血清型CWL029株に対する遺伝子破壊株用プラスミドベクターの形質転換によって得られた菌株について、標的遺伝子をPCR法によって増幅したところ、野生型1,173-bpか遺伝子破壊株2,993-bpの増幅断片長が得られるところが、約600-bpから約4-kbpまでの複数の断片長が混在する煩雑な状態であった。これらの塩基配列決定を行うために、限界希釈法によるリクローニングを経た後にPCR断片塩基配列の決定を行う予定であったが、アガロースゲル電気泳動の電気泳動DNA断片を抽出した後にTAクローニングを実施してから塩基配列解析を行うことにより、目的の遺伝子破壊株の樹立に成功しているかについて確認する。もし目的の遺伝子破壊株の樹立に成功していなかった場合には、電気穿孔法の実施条件を見直し、より効率の良い形質転換法を探索する。また、遺伝子破壊用プラスミドベクターに用いている発現プロモーターについて、その転写効率を確認していなかったため、プロモーター配列の転写活性を評価する。
また、遺伝子再導入用プラスミドベクターについて、電気穿孔法による形質転換後にアンピシリンを用いた薬剤選択によって全く肺炎クラミジアクローンが得られていなかった。そのことから、今現在利用している遺伝子再導入用プラスミドベクターは肺炎クラミジアにおけるシャトルベクターとしてはおそらく機能しないと考えられる。その為、このシャトルベクターを用いた遺伝子再導入を断念し、その他のプラスミドベクターの提供を検討している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和元年度に購入予定だった倒立蛍光顕微鏡の金額の予算が不要になったこと、昨年度のコロナ禍による学会のへの参加活動を自粛したこと、研究の進捗の遅れによる論文執筆の遅れによってできた使用額の差である。
今後の新たなプラスミドベクター構築、形質転換、使用する肺炎クラミジア株の購入、免疫学的解析試薬購入経費などへ充てることにより遅延している研究を進める予定である。
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