| 研究課題/領域番号 |
19K16929
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| 研究機関 | 順天堂大学 |
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研究代表者 |
緒方 洵 順天堂大学, 医学部, 博士研究員 (20825179)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | VPS13C / Parkinson's disease / オルガネラ接点 / 神経変性 |
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| 研究実績の概要 |
VPS13Cの結合分子を同定するために、HEK293T細胞株においてFLAG-VPS13C, BioID2-VPS13Cを発現する安定発現株を作成した。タグの挿入位置はこれまで酵母で報告されている情報を参考にし、VPS13Cの機能に影響を与えない領域を選択した。また、遺伝子は巨大でありウイルスによるパッケージングが困難であるため、Invitrogen社のFlp-Inシステムを利用して樹立した。両細胞株を用いた免疫沈降、細胞内標識と質量分析により、結合分子を同定した。同定したアダプター分子とVPS13Cの共局在化は、免疫抗体染色と共焦点レーザー顕微鏡による観察では検出されなかった。原因として免疫染色によるVPS13Cのシグナル強度が弱いことがあげられる。そこで上記方法を用いてEGFP-VPS13C安定発現株を樹立し、ライブイメージングを行った結果、生細胞では十分なシグナルが得られたので現在アダプター分子との共局在化、各オルガネラ接点における局在を検証している。また、同定したアダプター遺伝子の発現をsiRNAの遺伝子導入により抑制した結果、VPS13Cの発現が有意に減少することが分かった。そのため、今後は結合ドメイン同定を行う予定である。
また、当講座のゲノム解析により検出された新たな病因候補変異から、新規病因変異を同定するために、変異を挿入したVPS13Cを発現するトランスジェニックハエを作成した。Vps13 KOハエでは視神経の活動に異常が起こることが分かったため、この表現型を指標に各候補変異によりレスキューされるか検証する。また、上記アダプター分子との遺伝的相互作用についても、同様に検証する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
免疫染色による検出ではVPS13Cの十分なシグナル強度が得られなかったため生細胞による観察に変更した。そのため、新たに蛍光タグを挿入した安定発現株の作成を行う必要がでたため、当初の計画より進行が遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
オルガネラ接点における機能を解析することが目的であるため、新たに作製した蛍光タグが挿入された安定発現株を用いて各種オルガネラへの局在、オルガネラ接点の機能を解析する。また、新たに明らかにした視神経の変性は電気生理的方法により簡便に定量化できるため、ハエを用いた神経変性の実験で利用する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の遅れにより次年度使用分が発生した。翌年度分の予算と合わせて、本年度行うはずだったベクター構築のための合成オリゴの購入に使用する。
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