| 研究課題/領域番号 |
19K16949
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
永澤 元規 大阪大学, 医学系研究科, 招へい教員 (00823535)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | αシヌクレイン / 血管内皮 / 炎症 / eNOS / 血管透過性 / オリゴマー / 老化 |
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| 研究実績の概要 |
これまで、αシヌクレイン（SNCA）モノマーは血管内皮細胞においてeNOS活性化作用、抗炎症作用を有し、血管内皮機能に対して保護的な作用を呈するが、pre-formed fibril(PFF)は炎症を惹起し、eNOSの発現を低下させることを確認した。
①分化させたSH-SY5Y神経細胞にレンチウイルスにてSNCAを発現させ、そのconditioned mediumをHUVECに添加することにより、神経細胞由来のSNCA oligomerによる炎症性サイトカインの発現をqPCRにて評価したが、コントロール（GFP)に比して変化が認められなかった。
②神経細胞由来のPFFがTLR2を介してミクログリアの炎症を惹起する（Nat Commun. 2013;4:1562.）との報告よりPFFが血管内皮においても炎症を惹起するメカニズムとしてTLR2を介する可能性を考えた。HUVECにPFFやTLR2のagonistであるPam3CSK4を添加するとTLR2の発現が上昇することをqPCRにて確認した。
③HUVECにおけるPFFによる炎症のメカニズムの検討のためにTLR2のsiRNAによるノックダウン効率を検討したところ、効果的な発現減少が得られることをウエスタン・ブロットにて確認した。
④PFFをミクログリア（HMC3、MG6)に添加し、mediumの交換後、そのconditioned mediumをHUVECに添加することで脳における血管内皮とミクログリアのPFFによる炎症惹起の相互作用を検討したが、有意な結果は得られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
PFFをHUVECに添加した際に、HUVECの炎症状態が実験ごとに変化し、安定せず、次の実験進めなかった経過があった。検討したところ、sonicationを行うことによる毒性の悪化の可能性が考えられ、検討中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
①HUVECにおけるTLR2を介したPFFによる炎症惹起のメカニズムとしてTLR2のsiRNAによるノックダウンの系にて検討する。
②血管内皮におけるPFFの血管透過性への関与を検討する。culture insertにHUVECを培養し、蛍光標識デキストランを添加することでlower chamberに透過してくる蛍光標識デキストランを定量することで評価する。現在、TNF-αをpositive controlとして本実験系が成立することを確認している。また、TNF-αによるtight junction関連の分子発現変化も確認している。本実験系にてPFFの血管透過性への関与を検討する。また①により、PFF作用がTLR-2を介する可能性がある場合にはTLR2のsiRNAを用いても検討する。
③①においてPFFが血管内皮細胞においてTLR2を介して炎症を惹起する可能性が認められた場合、in vivoの系にても検討する。WTの脳にPFFを投与し、血管内皮の炎症性分子の発現を組織学的に検討し、更に血管透過性の亢進の有無も検討する。更にTLR2 antagonistを腹腔内投与することによる血管内皮での炎症や血管透過性の軽減の有無を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度もin vitroの実験系が中心であり、既存の消耗費も多く、当初の予定よりも研究費の使用が少なかった。来年度は引き続きのin vitroの実験に加え、動物実験も予定しているため、次年度に繰り越した研究費を用いる予定としている。
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