| 研究課題/領域番号 |
19K16996
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| 研究機関 | 千葉大学 |
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研究代表者 |
山本 雅 千葉大学, 大学院医学研究院, 特任研究員 (40825064)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ウェルナー症候群 / 細胞老化 / HDL / コレステロール |
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| 研究実績の概要 |
今年度はウェルナー症候群（WS)細胞のコレステロール代謝を破綻させる因子について主に検討した。まず、健常者ならびにWS患者の皮膚より線維芽細胞を確立し、コレステロール代謝関連遺伝子の発現を比較した。さらに、健常者ならびにWS患者の末梢血単核球より樹立したiPS細胞を間葉系幹細胞および脂肪細胞に分化させ、線維芽細胞と同様に遺伝子発現を比較した。その結果、皮膚線維芽細胞、間葉系幹細胞、脂肪細胞のいずれにおいてもコレステロール代謝関連遺伝子の発現に差を認めなかった。一方、WS患者の血液中にコレステロール搬出能を低下させる因子がある可能性を昨年度確認している。そこで、（１）健常者とWSの線維芽細胞中では差を認めず、かつ健常者とWSの血中エクソソーム内では差を認めるmicroRNA、（２）健常者細胞とWS患者細胞で分泌量の異なるプロテオームに着目した。
（１）microRNA解析：候補microRNAのうち、発現量の差が大きいmicroRNA-16、microRNA-22、microRNA-128を健常者由来皮膚線維芽細胞に過剰発現させた。その結果、microRNA-128を過剰発現した細胞では遊離コレステロールをエステル化して無毒化する酵素のACAT1発現が低下した(N=3)。現在microRNA-128が細胞のコレステロール代謝関連遺伝子発現を変化させる機序の解明に取り組んでいる。
（２）プロテオーム解析：健常者およびWSのiPS細胞から分化させた間葉系幹細胞の培養上清のプロテオーム解析を試行したところ、IL-8を含む複数のプロテオーム分泌に差があることを確認した。IL-8はABCA1発現を負に制御することが知られており、WSの脂質代謝を破綻させる一因である可能性がある。その他のプロテオームについてもコレステロール代謝に与える影響を検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
WSでコレステロール代謝を破綻させる因子について、microRNAとプロテオームの両面から探索を行った。その結果、microRNAとプロテオーム双方について複数の候補因子を挙げることができ、かつその一部はコレステロール代謝に影響を与えることが既知であるか、研究室でコレステロール代謝にかかわる遺伝子発現を変化させることを確認できている。候補となる物質が複数あり、どの候補因子について解析を進めるか検討する必要があるが、コレステロール代謝破綻因子の探索はおおむね計画通り進んでいると考えている。
研究の律速因子となるのが健常者ならびにWS患者血液の確保である。今年度の解析から、コレステロール代謝を破綻させる因子を培養細胞から得ることは困難である可能性が考えられた。現在血液からエクソソームを回収する方法として超遠心法を用いているが、解析に大量の血液を必要とするためボランティアならびに患者の負担が大きい。そこで、より少量の血液から解析に必要な量のエクソソームを回収する方法を探索するため、超遠心法に加え、ペレットダウン法および免疫沈降法を用いたエクソソームの回収を試みた。しかしながらペレットダウン法および免疫沈降法ではエクソソームを安定して回収することができなかった。そこで、超遠心に用いる血漿を希釈するなど、より少量の血液からエクソソームを回収することができないか等、研究方法の改良にも取り組んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
（１）コレステロール代謝を破綻させる因子を探索する手法の改良：少量の血液から血中エクソソーム内microRNAの回収を行うため、ペレットダウン法で用いるカラムを変更してエクソソームを得ることができるかを評価する。また、血液を段階希釈し、希釈した血液から超遠心法でエクソソームが回収できるかを検討する。これらの方法でコレステロール代謝破綻因子の解析手法を改良し、より低侵襲にスクリーニングを行う手法を開発する。
（２）コレステロール代謝を破綻させる因子の絞り込み：現状では候補となるmicroRNAならびにプロテオームが多岐にわたり、それらすべてを解析することは困難である。そこで、候補となる因子の絞り込みを目指す。 （１）の成果をもとに、より多数の健常者ならびにWS患者に研究への参加を依頼する。参加いただく人数が増えることで、個々の病態に依存せず、健常者とWSで特徴的に分離される因子を特定する。
（３）コレステロール代謝を破綻させる因子の作用メカニズムの解明：（２）で絞り込んだ候補microRNAの野生型細胞への過剰発現やWS細胞への発現抑制実験、あるいは細胞へのプロテオーム添加実験を行う。操作を行った細胞の老化兆候をSA-β-ガラクトシダーゼ染色や細胞周期関連遺伝子の発現解析、テロメア長アッセイなどにより評価する。さらにそれらと細胞内に存在する脂質量の関連解析を行う。上記で明確な差を認めなければ、ABCA1を薬理学的に阻害しコレステロール搬出を阻害したうえでの差を比較する。さらに、RNAシークエンスなどの手法をもとに脂質代謝破綻や細胞老化が促進したメカニズムの解明を目指す。
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