| 研究課題/領域番号 |
19K17011
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
司城 昌大 九州大学, 医学研究院, 共同研究員 (80822155)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 脳梗塞 / グリア瘢痕 / アストロサイト / ミクログリア / ANXA1 / 制御性T細胞 / CCL20 |
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| 研究実績の概要 |
令和元年度はヒト脳梗塞組織切片(剖検組織14症例20標本、手術組織10症例10標本)及び非虚血病変組織切片(剖検組織14対応症例14標本、手術組織8症例8標本)を作製し、免疫組織化学染色法で標的蛋白分布(ANXA1、アストロサイト形態・機能標識蛋白(AQP4、EAAT1)、ミクログリア形態・機能標識蛋白など)を解析した。マウスと異なりヒト脳梗塞において、1)梗塞辺縁のアストロサイトにおけるANXA1蛋白の高発現像や障害細胞突起でのAQP4/EAAT1との共局在より、虚血時の浮腫・グルタミン酸負荷応答としてANXA1発現・細胞内局在変化を呈すること、2)梗塞内部マクロファージと梗塞辺縁TMEM119陽性組織常在性ミクログリアでのANXA1発現差異(前者のみANXA1発現亢進)より、炎症担当細胞では組織起源や機能に応じてANXA1応答が異なることを示唆した。
令和2年度はヒト脳梗塞の組織学的解析を継続し、汎T細胞、組織保護作用を有する制御性T細胞(Treg)やT細胞遊走性ケモカイン(CCR6-CCL20、CCR7-CCL19)の発現動態を検証した。その結果、1)CCR7陽性ナイーブT細胞(梗塞内部・辺縁に広く分布)とCCR6陽性Treg(梗塞境界周囲に集中)の分布差異、2)梗塞内部や境界周囲のミクログリア・マクロファージ(CCL19のみ発現亢進)と梗塞境界周囲のアストロサイト(CCL19,20の発現亢進)でのケモカイン発現差異、3)アストロサイト内のCCL20分布がANXA1と同様に梗塞境界の障害細胞突起へと集積した点を見出した。アストロサイトや炎症担当細胞によるケモカイン発現差異により機能サブセット毎のT細胞の空間選択的誘導を呈し、局所の炎症強度変化に寄与する可能性がある。またヒト脳梗塞時のTreg分布は既報の動物実験結果とは異なり、この挙動にヒト特異的要素を含む可能性がある。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
COVID-19への対応のため交配や遺伝子導入などの長期間を要する動物実験が実施困難な状況が続いており、in vivoでの実験データ集積が滞っている。このためヒト脳梗塞での組織学的解析や培養細胞を用いた生化学的解析を優先して遂行しており、特にヒト脳梗塞の組織学的解析は研究開始当初の計画以上のデータ集積が為されている。現在はヒト不死化アストロサイト細胞(U373MG株)を用いた生化学的解析手法確立(定量PCR法やウェスタンブロット法によるANXA1遺伝子・蛋白検出)の途上段階である。
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| 今後の研究の推進方策 |
COVID-19への対応のため、交配や遺伝子導入などの長期間を要する動物実験が実施困難な状況が続いている。当面はヒト病理標本を用いた組織学的解析、およびヒト・マウス由来細胞を用いた生化学的解析を進めるが、動物実験のための環境調整も併せて試みる。
令和3年度の目標として、(1)ヒト脳梗塞標本の組織学的解析として、他のT細胞機能サブセット(IL-17産生γδT細胞や他のTh17細胞など)やその遊走ケモカイン、組織保護性ミクログリア(MSR-A, CD163など)の分布解析を試みる。(2) U373MG株を用いた生化学的解析手法の確立や、それを基盤とした虚血環境模倣刺激実験(低酸素負荷：BIONIX低酸素培養キットを使用、低グルコース負荷、グルタミン酸過剰負荷、LPSや免疫調整因子の負荷)を急ぎ、ANXA1発現規定因子の同定や種々の細胞機能(生存・形態変化など)との関連性を追求する。加えてヒトないしマウスアストロサイト初代継代細胞での実験を通して、種間のANXA1挙動差異を検証する。さらにANXA1遺伝子強制抑制実験を行い、各種刺激に対する反応変化を評価し、アストロサイトにおけるANXA1の機能同定を目指す。(3)動物実験に関しては、C57/BL6野生型マウスMCA閉塞脳梗塞モデルにおけるAnxa1の分子生物学的動態、発現細胞の病理組織学的挙動の検証を目指す。
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