パーキンソン病発症メカニズムにおけるリソソーム病の新たな病態関与の探索

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K17019
• 研究機関: 順天堂大学
• 研究代表者: 王子 悠 順天堂大学, 医学部, 助教 (60777845)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2023-03-31
• キーワード: パーキンソン病 / リソソーム病 / プロサポシン / サポシンD / スフィンゴ脂質 / スフィンゴミエリン / αシヌクレイン

研究実績の概要

研究代表者は3家系の常染色体優性遺伝性パーキンソン病(PD)患者において、リソソーム病の原因遺伝子であり、スフィンゴ糖脂質代謝に広く関与するプロサポシン(PSAP)の新規遺伝子変異を世界に先駆けて同定し国際学術誌にその成果を報告した(Oji, et al. Brain 2020)。本課題では、PSAP遺伝子変異PD患者由来iPS細胞やPSAP遺伝子変異導入マウスを用い細胞内脂質組成の変化に着目した解析を行い、PDの病態解明や治療ターゲットの鍵となる脂質組成を探索することを目的とする。PSAPサポシンD領域の遺伝子変異を持つPD患者(C412Yヘテロ接合体変異)から得られたiPS細胞をドパミン神経細胞に分化させ、脂質抽出を行った後に薄層クロマトグラフィー(TLC)にて展開・分離を行い、各画分を有機溶媒で抽出したサンプルについて質量分析(LC/MS)を行った。PSAPサポシンD領域変異(C412Y)PD患者のiPS細胞由来ドパミン細胞では健常コントロールに比べてスフィンゴミエリン(SM)の増加を示唆する結果が得られた。SMの蓄積の結果は、サポシンD分子の機能障害に起因するリソソームにおけるSM分解障害や、サポシンDドメインの障害によるSMを介した正常なPSAPリソソーム輸送の障害を原因としている可能性が考えられた。SMはPDの特徴的脳病理所見であるレビー小体の主要構成蛋白であるαシヌクレインの発現に影響するという報告もあり(Kin WA, et al. J Parkinson Dis 2012)、サポシンD領域PSAP変異が細胞内SM量を変化させ、αシヌクレイン発現レベル増加をもたらしPDを発症する可能性が考えられた。SMを分解する酸性スフィンゴミエリナーゼの原因遺伝子SMPD1がPDの発症遺伝手的リスクでもあり、SMはPD病態に重要である可能性が高いと考えられた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

PSAP遺伝子変異PD患者由来のiPS細胞の脂質解析で、変化を来している脂質としてスフィンゴミエリンを同定しつつあり、現在再現性を確認している段階である。再現性の確認後にスフィンゴミエリンを含むリポソームを作製しPK処理後にウェスタンブロット法でαシヌクレイン凝集を確認する実験にも着手できる段階である。また、SM分解に関連するリソソーム酵素活性の測定もiPS細胞の培養状況を確認しながら迅速に評価できる。サポシンD領域遺伝子変異導入マウスにおいてもスフィンゴ脂質変化、運動障害、およびドパミン神経変性の表現型を呈することはすでに既報告があるが(Matsuda, et al. Hum Mol Genet 2004, Oji et al. Brain 2020)、マウスにおけるSMの変化について追加解析する準備も進んでいる。これらの進捗状況からおおむね順調に進展していると考えられる。

今後の研究の推進方策

PSAPサポシンD領域遺伝子変異を持つPD患者のiPS細胞由来ドパミン神経細胞や、サポシンD領域遺伝子変異導入マウスでSM蓄積を確認できた場合には、SM分解を促進する、ないしはSM合成を制御する薬剤の探索を行う。PD患者の脳病理の特徴的病理所見であるレビー小体はαシヌクレインを主要構成蛋白とするが、レビー小体は脂質も多く含んでおり中でもSMが最も多く含まれると報告されている(den Jager WA. Arch Neurol 1969) 。薬剤スクリーニングの結果、SM量を制御できる薬剤を発見した際には、特発性PD患者のiPS細胞由来ドパミン神経細胞について候補薬剤で処理を行いαシヌクレイン量の低下など表現型の改善の有無を解析する。これらの解析によりPDの病態解明および治療ターゲットとしてSMが重要かどうかを研究していく方策である。

次年度使用額が生じた理由

2019年度のiPS細胞の実験についてはコントロールのiPS細胞を1ライン、PSAP遺伝子ヘテロ接合体変異(C412Y)を持つパーキンソン病患者のiPS細胞を1ライン、計2ラインで実験を行った。2020年度はコントロール1ラインの他に、CRISPR-cas9を用いたC412Y変異導入(ヘテロ接合体、ホモ接合体)の2ラインを追加し解析実験を行う予定であり次年度使用額として請求させて頂く。

研究成果

• [雑誌論文] Variants in saposin D domain of prosaposin gene linked to Parkinson’s disease (2020)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Oji
  • 雑誌名: Brain 巻: 143 ページ: 1190-1205
  • DOI: 10.1093/brain/awaa064
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Variants in saposin D domain of prosaposin gene linked to Park inson's disease (2020)
  • 著者名/発表者名: 王子悠, 波田野琢 , 上野真一, 舩山学, 石川景一, 奥住文美, 常深泰司, 李元哲, 松田純子, 服部信孝
  • 学会等名: 第61回日本神経学学術大会
• [学会発表] Variants in the saposin D domain of prosaposin gene are linked to Parkinson's disease (2020)
  • 著者名/発表者名: Yutaka Oji, Taku Hatano, Shin-Ichi Ueno, Manabu Funayama, Kei-ichi Ishikawa, Ayami Okuzumi, Shigeto Sato, Yuanzhe Li, Taiji Tsunemi, Hiroyo Yoshino, Kenya Nishioka, Matthew J Farrer, Yasuo Uchiyama, Wado Akamatsu, Yih-Ru Wu, Junko Matsuda, Nobutaka Hattori
  • 学会等名: International Congress of Parkinson's Disease and Movement Disorders
  • 国際学会