| 研究課題/領域番号 |
19K17222
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| 研究機関 | 東北大学 |
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研究代表者 |
橋本 拓磨 東北大学, 医学系研究科, 助教 (50799145)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 低酸素 / 放射線抵抗性 / 転写因子 / DNA修復酵素 |
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| 研究実績の概要 |
重度な低酸素状態の細胞は高い放射線抵抗性を示すが、低酸素状態における放射線抵抗性を制御する分子機序の詳細は明らかになっていない。これまでに、SV40でトランスフォームされたヒト線維芽細胞LM217において、1)放射線抵抗性に関与するDNA2重鎖切断修復酵素ATMおよびDNA-PKcsの活性化や発現量が重度な低酸素処理により亢進すること、2)ATMの活性化および発現量の亢進は、エネルギーバランスセンサーであるAMPKを介していることが明らかになっている。本研究では、腫瘍細胞を用いて、重度な低酸素状態により誘導される転写因子の探索を行うとともに、AMPKを介した放射線抵抗性の分子制御機構の解明を目指している。
前年度は、重度な低酸素状態のヒト神経膠芽腫細胞T98Gにおいて、転写因子Sp1がATMの発現制御の役割を担っていること、さらにAMPKがSP1の上流因子であることを明らかにした。本年度は、Sp1およびAMPKが細胞の放射線抵抗性に寄与するかを検証した。その結果、AMPKをノックダウンした条件において放射線抵抗性が有意に低下した。Sp1をノックダウンした条件においては細胞は致死であった。AMPKをノックダウンした条件において細胞周期解析を行ったところ、放射線抵抗性であるS期の細胞の割合の増加はみられなかった。これらの結果から、低酸素におけるAMPKを介した放射線抵抗性の分子機構にはS期の割合が依存しないことが示唆された。また、DNA-PKcs、およびその関連タンパク質EGFR、SrcへのAMPKの影響を調べたところ、AMPKをノックダウンしてもDNA-PKcs、EGFR、Src、Aktの発現量や活性化への影響はみられなかった。この結果から、低酸素条件下のヒト神経膠芽腫細胞においては、DNA-PKcsを制御する分子機構はAMPKと独立している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は、Sp1およびAMPKが低酸素条件下の細胞の放射線抵抗性に寄与するかを検証し、その結果、S期に依存しないAMPKを介した分子制御機構の存在を見出した。AMPK/Sp1/ATMの経路が低酸素条件における腫瘍細胞の放射線抵抗性に寄与していることを見出したことは、本研究課題を遂行する上で重要であり、順調に進展していると判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本年度の結果から、AMPKが低酸素状態における細胞の放射線抵抗性に寄与していることが明らかになったが、細胞死にアポトーシスが関与している可能性が考えられる。そのため、アポトーシス応答の重要な調節因子であるCaspase-3および-8を指標としたアポトーシスアッセイを行う。また、他の腫瘍細胞株やATMの機能がない細胞 (AT患者由来細胞の繊維芽細胞)について、低酸素条件下におけるAMPK/Sp1/ATMの経路の影響を調べる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
他の腫瘍細胞株、抗体（未購入）を用いたアッセイや、Sp1・FoxO3aとATM・DNA-PKcsとの相互作用を検証するための免疫沈降法のアッセイが次年度に行うことになったため、次年度使用額が生じた。また、重度な低酸素状態を維持するための混合気体や低酸素チャンバーを購入する予定である。
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