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in vivoの実験に先立ち、不死化処理を施した前駆褐色脂肪細胞株であるCB1細胞を用いたin vitroの実験を行った。CB1細胞に対する分化誘導開始日をday0とし、day0からAngiotensin1-7(Ang1-7)や比較対象としてCL316243(選択的β3アドレナリンレセプターアゴニスト)を投与しday2、4、6、8にｍRNAを抽出し薬剤無投与をコントロールとして、褐色脂肪細胞(BAT)の分化増殖に関わる蛋白や、Ang1-7の受容体であるMasReceptor(MasR)、交感神経刺激を介したBAT活性化の起点となるβ3アドレナリンレセプター(β3ADR)のｍRNAの発現を比較した。その結果、BATの早期の分化促進に対して、β3-ADRを介した経路は寄与する度合いが低いと考えられ、早期の段階においてAng1-7がMasRを介する経路がBATの分化促進には重要であることがわかった。
また、上記と同じ実験系においてWestern blotで蛋白発現の変化について検証した。BATの熱産生に関わる蛋白であるUCP1はAng1-7投与群で発現が増加した。一方、脂肪滴の成熟マーカーであるperilipinが、Ang1-7投与により経時的に減少したことから、Ang1-7投与により脂肪が分解されたことが示唆された。UCP1発現増加に重要なp38-MAPKは、Ang1-7投与によりリン酸化が増加した。また、Ang1-7投与によりAMPKのリン酸化も増加した。ことも踏まえ、Ang1-7にはMas receptorを介して褐色脂肪細胞を直接活性化する作用が存在することが明らかになった。そこで、以前に作成した若齢マウスでは直接作用を来す経路が明確とならなかったため、加齢肥満マウスを作成し、Ang1-7投与による体重や各種代謝パラメータの変化の比較を試みたが、有意な差が認めなかった。
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