| 研究課題/領域番号 |
19K17340
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
関 満 自治医科大学, 医学部, 講師 (20822357)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | ファロー四徴症 / ノックアウトラットモデル |
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| 研究実績の概要 |
ファロー四徴症は根治手術後も進行性の上行大動脈拡大に伴う大動脈弁閉鎖不全や大動脈瘤/解離を起こし、致死的となりうる。病因として、大動脈壁の中膜嚢胞性壊死による血管弾性低下と血管硬度上昇が考えられる。この組織学的変化、大動脈変性の機序解明を目的としてファロー四徴症ラットモデルを作成する。Hey2ノックアウトマウスがファロー四徴症となることが報告されており、まず、CRISPR/Cas9を使った遺伝子変異によるHey2ノックアウトラットを作出することから研究を開始している。自治医科大学再生医学研究部の魚崎英毅研究室にてCRISPR/Cas9を用いて、ファロー四徴症の原因遺伝子として知られているHey2遺伝子をノックアウトさせた遺伝子改変ラットの作製を行なっている。Hey2はホモノックアウトでファロー四徴症となるので、Hey2 del/+ラットを導入し、Wistarラット(オス・メス５匹を予定)と交配し、Hey2 del/+ラットを繁殖、Hey2 del/+ラット同士を交配することで、Hey2 del/delラットを得る。現在はファロー四徴症ラットモデル作出のためのGuide RNA設計が終了し、交配を進めている段階である。今後、得られたマウスの表現型の確認を行う予定としている。本研究ではノックアウトラットを作出することで、形態観察のみならず、マウスでは小さすぎて行うことができない新生仔～小児期における大動脈血管壁硬度、組織学的変性の有無を評価することが可能となり、より生理的な研究に発展すると考えられる。得られたラットモデルの表現型の確認は、胎生後期あるいは新生仔において、麻酔下で頚椎脱臼により安楽殺し、心臓を摘出し、その形態・病態の解析を予定している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在はファロー四徴症ラットモデル作出のためのGuide RNA設計が終了し、交配を進めている段階である。今後、得られたマウスの表現型については胎生後期あるいは新生仔において、麻酔下で頚椎脱臼により安楽殺し、心臓を摘出して確認する。Guide RNAの作成や遺伝子改変ラット作成のための学内準備のために時間を要したため、進捗状況としては当初の予定よりもやや遅れいてるが、ノックアウトラットの交配を進めている段階であるが、次年度はラットモデルを用いて解析を進めることが可能であると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
得られたファロー四徴症ラットおよびコントロールラットから胎生期を含め、経時的に大動脈組織を摘出する。大動脈壁組織はH-E染色及びElastica Van Giesen染色により血管壁の中膜病変を主とした組織学的変性の有無、その進行の程度を解析する。さらにファロー四徴症の大動脈拡大に関わる中膜病変形成にはTGF-βシグナリングの異常が関与していることが示唆されており、。大動脈壁におけるTGF-βシグナリング活性化の有無を検証することでファロー四徴症における血管特性を明らかにする。より詳細に血管硬度を評価するために摘出した上行大動脈を長軸方向に切り開いてシート状とし、バイオマテリアル機能特性測定システムを用いて、血管の弾性と硬度を測定することも予定している。これらを組織学的所見と比較検討を行うことで、動物モデルにおいても血管壁の組織学的変性と血管硬度の関係性を証明することが可能となる。
研究推進における課題としてはHey2ノックアウトラットの心臓表現型がファロー四徴症を呈さない可能性が残っていることである。その場合は他に報告のあるファロー四徴症関連の遺伝子変異を導入し、ラットモデルを作出することを考えている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の研究計画では当該年度にファロー四徴症ラットモデルの作製およびそのモデルの評価として、大動脈壁の組織学的検討や免疫染色、ウエスタンブロッティングによる病態の解析を行う予定としていた。モデル作製の開始に遅れが生じたため、該当年度の予算の一部を次年度に使用する必要が生じている。次年度は当初の予定していたバイオマテリアル機能特性測定システムを用いて血管弾性と血管硬度の測定も行うこととしており、翌年度分として請求した助成金と合わせて研究を進める。また、モデル作製開始の遅れから当初予定していた学会での発表などを行うことができなかったため、旅費として申請した予算を次年度の研究成果発表に充てることとしている。
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