2022 年度実施状況報告書

ファロー四徴症ラットモデルを用いた大動脈壁血管変性メカニズムの解明

研究課題

研究課題/領域番号	19K17340
研究機関	自治医科大学
研究代表者	関満自治医科大学, 医学部, 講師 (20822357)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2024-03-31
キーワード	ファロー四徴症 / ノックアウトラットモデル
研究実績の概要	ファロー四徴症は根治手術後も進行性の上行大動脈拡大に伴う大動脈弁閉鎖不全や大動脈瘤/解離を起こし、致死的となりうる。病因として、大動脈壁の中膜嚢胞性壊死による血管弾性低下と血管硬度上昇が考えられる。この組織学的変化、大動脈変性の機序解明を目的としてファロー四徴症ラットモデルを作成する。 Hey2ノックアウトマウスがファロー四徴症となることが報告されており、まず、CRISPR/Cas9を使った遺伝子変異によるHey2ノックアウトラットを作出することから研究を開始している。自治医科大学再生医学研究部の魚崎英毅研究室にてCRISPR/Cas9を用いて、ファロー四徴症の原因遺伝子として知られているHey2遺伝子をノックアウトさせた遺伝子改変ラットの作製を行なっている。Hey2はホモノックアウトでファロー四徴症となるので、Hey2 del/+ラットを導入し、Wistar ラットと交配し、Hey2 del/+ラットを繁殖、Hey2 del/+ラット同士を交配することで、Hey2 del/delラットを得ることができた。ファロー四徴症ラットモデル作出のための Guide RNA設計し、交配を行った結果、効率よくノックアウトされていた。現在、得られた遺伝子改変ラットの表現型の確認を行っており、心血管腔内に色素を注入し、心内構造、血管奇形の評価を行なってる。また、表現型の確認のため、組織透明化技術を用いて心臓奇形を３次元で把握する準備を進めている。心臓および大血管の切片を作成し、組織学的な解析を進めており、想定される表現系が得られた場合は遺伝子改変ラットを再度作出し、長期に生存させることで血管病変のより詳細な検討を行う予定である。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由現在はファロー四徴症ラットモデル作出のためのGuide RNA設計が終了し、交配して得られたマウスの表現型の評価を行っている段階である。しかしながら、 COVIDー19パンデミックにより予定通りの研究を進めることができておらず、進捗状況としては当初の予定よりもやや遅れいてるが、その解析を進めている段階であり、次年度への延長申請を行った。
今後の研究の推進方策	本研究ではノックアウトラットを作出することで、形態観察のみならず、マウスでは小さすぎて行うことができない新生仔~小児期における大動脈血管壁硬度、組織学的変性の有無を評価することが可能となり、より生理的な研究に発展すると考えられる。大動脈壁組織はH-E染色及びElastica Van Giesen 染色により血管壁の中膜病変を主とした組織学的変性の有無、その進行の程度を解析する。さらにファロー四徴症の大動脈拡大に関わる中膜病変形成にはTGF-β シグナリングの異常が関与していることが示唆されており、大動脈壁におけるTGF-βシグナリング活性化の有無を検証することでファロー四徴症における血管特性を明らかにする。より詳細に血管硬度を評価するために摘出した上行大動脈を長軸方向に切り開いてシート状とし、バイオマテリアル機能特性測定システムを用いて、血管の弾性と硬度を測定することも予定している。これらを組織学的所見と比較検討を行うことで、動物モデルにおいても血管壁の組織学的変性と血管硬度の関係性を証明することが可能となる。研究推進における課題としてはHey2ノックアウトラットの心臓表現型がファロー四徴症を呈さない可能性が残っていることである。その場合は他に報告のあるファロー四徴症関連の遺伝子変異を導入し、ラットモデルを作出することを考えている。正確な表現型の同定のために心臓奇形を三次元で観察できることが望ましく、現在、ABiSを介して順天堂大学の洲崎研究室に技術提供・指導をいただいており、組織透明化技術を用いて観察を行うことを計画している。
次年度使用額が生じた理由	当初の研究計画では当該年度にファロー四徴症ラットモデルの作製およびそのモデルの評価として、大動脈壁の組織学的検討や免疫染色、ウエスタンブロッティングによる病態の解析を行う予定としていた。COVID-19パンデミックにより研究に遅れが生じたため、該当年度の予算の一部を次年度に使用する必要が生じている。次年度は解析に関する研究消耗品の購入及び今後現地参加可能となる学会旅費として申請した予算を充てることとしている。