| 研究課題/領域番号 |
19K17352
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立成育医療研究センター |
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研究代表者 |
山田 全毅 国立研究開発法人国立成育医療研究センター, 高度感染症診断部, 医長 (30445316)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| キーワード | EBV / リンパ増殖性疾患 / Transcriptome |
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| 研究実績の概要 |
当該年度の実績として、引き続きEBV関連T/NK細胞性リンパ増殖性疾患（EBV-NK-LPD）の病態解明を目的としたsingle cell RNA seq（scRNAseq）実験技術と解析方法の確立が挙げられる。
本計画は当初、移植後EBV関連リンパ増殖性疾患に対する免疫応答を中心とした病態解明を目的とし、3年間の計画で申請したが、2021年度に競合する研究結果が報告されたことで研究計画の大幅な見直しが必要となった。また新型コロナウイルスの流行による影響で研究活動が制限されたり、当初予定していたeffortが確保できなかったりした影響により全体としての研究状況は当初の予定より遅れているため、研究期間の延長申請を行った。
もともとは特に免疫応答の破綻メカニズムの解明を目的として、モデルマウスを使用した研究計画を開始したが、初年度に、モデルの疾患再現性の問題から免疫応答の評価が困難であったことを報告し、2020年より、EBV-T/NK-LPDにおけるリンパ増殖メカニズムの解明を主目的として研究を継続している。2022年度は疾患活動度の異なる患者から得たEBV感染NK 細胞の解析を目的としてscRNAseqを行い、EBV感染細胞における多様性や特徴について解析を試みた。解析を進める中で、scRNAseq解析によるEBV関連遺伝子の遺伝子の検出感度が著しく低い可能性が示唆されたため、in-situ hybridization flow cytometry法でEBV感染細胞の割合を比較したところscRNAseq解析ではEBV感染細胞の偽陰性が多くみられることが分かった。
今後non-coding RNA の検出効率を上げるため、scRNAseq実験方法を一部変更しデータ集積に努める予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
本研究の目的は、EBV-T/NK-LPDの発症メカニズムの解明である。これまで、ヒトのEBV感染細胞が多様性を有すること、末梢血と組織中の感染細胞の形質が異なることなど、臨床検体から明らかにし、さらにヒト化マウスEBV感染モデルを使用した病態研究を進めてきた。研究を進める中でヒト化マウスモデルにおける免疫応答の詳細な解析は困難でありかつ他の研究グループより、我々の計画に類似した研究報告がなされたことを受け、ヒト検体を直接使用したオミクス解析を応用し、本疾患の病態を解明できるよう方針を変更した。 10x Genomicsのプロトコールに従い、EBV感染細胞と非感染細胞集団の比較から、EBV感染細胞の特徴的な遺伝子発現パターンの解析を開始したが、実際に行った実験の方法ではEBV感染細胞の検出感度が低いことが判明した。具体的には本法で同定できたEBV感染細胞は対象となる細胞系列（ここではNK細胞）全体の1％程度であった。これによりEBV非感染細胞集団に、EBV感染細胞群が多数混在していることが予想され、実際に2群間の比較では遺伝子発現のパターンに有意な差を認めなかった。これを検証するため、より特定の細胞系統における感染細胞の割合を知るために、蛍光RNA probeを用いて、末梢血単核細胞を染色し、EBV感染細胞の同定を行う実験を行ったところ、上述のように同一細胞系列のEBV感染細胞の割合は40％にも達した。これにより現在行っているscRNAseq解析ではEBV感染細胞の検出が不十分であることが分かった。
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| 今後の研究の推進方策 |
EBV感染細胞の同定が不十分だった理由と対応策は主として以下の2点であると考えられた。
①Non-coding RNAの検出不良
EBV感染細胞の同定に使用されるEBV-encoded non-coding small RNAs (EBER)はその名が示す通り、タンパクへと翻訳されないが、EBV感染細胞に多量に存在するRNAである。上に報告したscRNAseqで使用した増幅法ではこれらのnon-coding RNAの検出が著しく不良となることが分かった。これは上述したRNA hybridization法で感染細胞同定をした結果との比較で確認されたため、non-coding RNAの検出により適した5’ prime法を採用して検出感度を改良する予定である。
②EBV感染細胞の脆弱性
scRNAseqでは生細胞を用いるが、死細胞除去の過程で凍結融解によるダメージをより受けやすいEBV感染細胞が除去された可能性は否定できない。これは3’ prime法で検出されるべきEBV関連遺伝子の検出の総和が1％程度、と非常に低かったことから予想されたが、証明が難しい。より生細胞の生存率を上げるように注意して検体管理を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前年度引き続きscRNAseq解析を行いこれに多くの時間を要したが、解析結果からEBV関連遺伝子発現によるEBV感染細胞の検出感度が非常に低いことが示唆された。このため、実験プロトコールを見直し、別の実験キットを特にEBV感染細胞に多く存在するnon-coding small RNAを含めて、scRNAseq 解析を行うには、実験プロトコールの見直しが必要と考えられた。新しい実験系の確立を完遂する予算は残されていないと考えられたが、他の研究費申請なども並行して行い、今後のヒト末梢血及び組織中における単離EBV感染細胞解析系の確立を目指す。
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