| 研究課題/領域番号 |
19K17373
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
古川 晶子 奈良県立医科大学, 医学部, 助教 (60596667)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | インヒビター / 血友病A / 遺伝子解析 |
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| 研究実績の概要 |
今年度は、１例新たにインヒビターが発生した軽症中等症血友病A患者を経験し、解析を実施した。遺伝子解析では点変異（E272K）を同定し、これまでに当科で経験したインヒビター保有軽症血友病A症例の中にも同じ変異を有する例が１例存在した。今回の症例ではインヒビター力価が低かったため、インヒビターの特性解析は困難であった。
また、これまでに経験したインヒビター保有軽症中等症血友病A患者の遺伝子解析で得られたF8遺伝子の点変異のうちP1809Lについて、同様の部位をマウスF8遺伝子に導入した軽症中等症血友病Aモデルマウスの作成を実施した。ヒト・マウス間の配列相同性を考慮し、マウスF8遺伝子におけるP1777L変異がヒトF8遺伝子のP1809Lに相当すると判断し、iGONAD法を用いてP1777Lをノックインしたところ、P1777Lのホモおよびヘテロマウスをそれぞれ１匹ずつ得られた（いずれも雌）。現在、これらのマウスより採血を行い、FVIII活性値や抗原値がヒトのP1809L変異患者と同等かどうかを測定中である。また同時に継代を実施しており、マウスが複数得られれば、昨年実施した重症血友病Aモデルマウスでの実験と同様に、軽症中等症血友病A症例においてもインヒビター発生メカニズムの解析に応用する予定である。
また、上記P1809L変異FVIIIについて、野生型FVIIIと立体構造上の相違点が存在するかどうかについて、タンパク質モデリングソフトを用いた構造解析を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度は新規のインヒビター発生症例が１例あった。インヒビター力価が低く、インヒビター特性の解析は困難であったが、遺伝子解析結果から当科で解析したインヒビター保有軽症血友病A症例の中に同じ変異の症例が１例あり、インヒビター発生リスクに影響がある可能性が示唆された。
また、マウスへの軽症中等症血友病AのiGONAD法による点変異導入が成功した。今後はこのマウスのFVIII活性値・抗原値を測定し、患者と同等であるかを確認した後に、インヒビターを発生させそのメカニズム解析をすすめることができる。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は新規症例が発生し遺伝子解析は実施できたが、インヒビター力価が低くインヒビターの特性については解析できなかった。今後、また新たに軽症中等症血友病A患者にインヒビターが発生した場合は、これまで同様にインヒビターの性質について解析し、遺伝子解析の情報を用いて変異FVIIIを作成、インヒビターによる抑制効果について解析し製剤由来FVIIIと比較する。差異があれば、インヒビター発生に影響を与える要因について同定する。FVIII構造上の相違点について解析し、インヒビター発生の要因となりうるかどうかを、蛋白リモデリングソフトによる解析をはじめとした解析で検討する。この検討により免疫原性に影響する構造や部位が同定できれば、低免疫原性を目指した新規FVIIIを設計し、BHK細胞を用いて発現させ、その機能を各種凝固機能検査にて評価する。また実際に血友病Aマウスへの投与も行い、治療薬としての有用性を評価する。
また対象患者が有する点変異のマウスF8遺伝子への導入が成功した。その変異がインヒビター発生リスクとなるかどうかを野生型マウスや当科で保有している重症血友病Aモデルマウスと比較検討する。さらにLPSを用いた敗血症モデルのみならず、今後は当科で解析したインヒビター保有軽症中等症血友病A患者の臨床経過においてインヒビター発生契機となったと考えられている、重症出血や手術時のFVIII製剤投与をモデリングしたマウスを作成し、インヒビター発生に影響を及ぼすかを検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度は該当症例が１例のみであり、かつインヒビター力価が低く解析困難であったため、解析費用が見込みよりも少なかった。
次年度は該当症例が新たに発生した場合の解析と、マウスモデルの解析に助成残金を使用する予定である。
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