遺伝学的アプローチによりドラベ症候群の分子ネットワークを明らかにする

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K17381
• 研究機関: 福岡大学
• 研究代表者: 石井 敦士 福岡大学, 医学部, 准教授 (90568825)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2021-03-31
• キーワード: てんかん / エクソーム解析 / 遺伝子解析 / 次世代シークエンサー / 発達性てんかん性脳症 / ドラベ症候群

研究実績の概要

ドラベ症候群は乳児期に多くは発熱に伴って発症し、その後は多彩な発作型を呈し、抗てんかん薬に抵抗性の難治性てんかんである。最終的には重度精神発達遅滞を来たし、発達性およびてんかん性脳症と呼ばれる。主たる病因遺伝子は電位依存性ナトリウムイオン（Na+）チャネル（NaV1.1）をコードするSCN1A遺伝子である。欧米では臨床的に診断されたドラベ症候群の約70％にSCN1A遺伝子の塩基置換や微細欠失が見られている。一方で、本邦では我々が448名のドラベ症候群患者に対してSCN1A遺伝子変異の探索を行ったところ変異が見られたのは42％であった。この違いは、ドラベ症候群の表現型が多彩であり、発症初期には臨床診断が困難である点がある。臨床的にドラベ症候群と診断されるなかで、SCN1A遺伝子変異を持つ群と、持たない群での表現型の明確な違いは不明瞭である。
そこで、多彩な表現型を持つドラベ症候群の病因となる遺伝子を網羅し、その遺伝子異常による神経細胞内の他の分子発現量の影響を明らかにし、分子ネットワークの全容を捉え、病態機序を明らかにすることを目的とした。
次世代シークエンサーによるSCN1A遺伝子を含む114個のてんかん関連遺伝子に対してパネルシークエンスを行い、変異同定に至らなかった86名のドラベ症候群症例に対して全エクソーム解析を行った。全エクソーム解析では、14名でSCN1A遺伝子に変異を検出した。残り72名のうち33名にde novoの病的バリアントを認めた。現時点では、33名中29名でPCRサンガー法で発端者と両親で確認し確定した。29名で同定した遺伝子は24遺伝子であった。てんかんで報告のない遺伝子についてcDNAを作成しin vitro実験の準備を行っている。既に新規の遺伝子が見つかったことは、ネットワークを同定するに重要な結果である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

1年間で72名のSCN1A遺伝子変異を持たないドラベ症候群とその両親に対して全エクソーム解析を行い33名にde novoの病的バリアントを同定している。それらは、24種類の遺伝子であり、ドラベ症候群ではSCN1A遺伝子以外の多くの遺伝子が原因となることが判明した。当初の予定通り、ネットワーク同定の目的でIn vitro実験の準備のため、cDNAを作成することができている。

今後の研究の推進方策

継続して、新規のSCN1A遺伝子変異を持たないドラベ症候群で全エクソーム解析を行っていき、より多くの遺伝子同定を行う。初年度に、全エクソーム解析で遺伝子同定に至らなかった39名に対しては、コピー数解析をXHMMとEXCAVATOR2を使用し行う。同定できない場合は、全ゲノムシークエンス、ロングリードシークエンスを行う。SCN1A遺伝子変異と同定した遺伝子変異を各々別々に培養神経細胞にCRISPR/Cas9で内在遺伝子に導入し、シングルセルRNAシークエンスを行い、細胞内の全遺伝子のRNA発現量を比較し、増減が共通する部分を抽出し、分子相関図をKEGG pathway (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html), STRING (https://string-db.org/)といったエビデンスに基づいたパスウェイプログラムで解析し、分子ネットワーク図を作成する。
作成した分子ネットワーク図を基に、SCN1A遺伝子がコードするNaV1.1と直接的に相互作用の報告がない分子を優先に免疫沈降やファーウエスタンブロットでNaV1.1との相互作用を確認する。間接的（機能的）作用については電気生理学的検証を行い確認する。この作業を、ネットワーク上の分子に網羅的に行い分子ネットワークを明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

当初は、次世代シークエンサーによるエクソーム解析での費用を主に見積もっていたが、他の研究でシークエンスしたデータを多く利用できたためエクソーム解析の費用が生じなかった。次年度は、新規のシークエンスが増え、細胞実験も増えるため繰越金をシークエンス費用に充てる計画である。

研究成果

• [雑誌論文] Clinical features of early myoclonic encephalopathy caused by a CDKL5 mutation (2020)
  • 著者名/発表者名: Takeda Kanako、Miyamoto Yusaku、Yamamoto Hisako、Ishii Atsushi、Hirose Shinichi、Yamamoto Hitoshi
  • 雑誌名: Brain and Development 巻: 42 ページ: 73～76
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2019.08.003
  • 査読あり
• [雑誌論文] Case-control association study of rare nonsynonymous variants of SCN1A and KCNQ2 in acute encephalopathy with biphasic seizures and late reduced diffusion (2020)
  • 著者名/発表者名: Shibata Akiko、Kasai Mariko、Terashima Hiroshi、Hoshino Ai、Miyagawa Taku、Kikuchi Kenjiro、Ishii Atsushi、Matsumoto Hiroshi、Kubota Masaya、Hirose Shinichi、Oka Akira、Mizuguchi Masashi
  • 雑誌名: Journal of the Neurological Sciences 巻: 414 ページ: 116808～116808
  • DOI: 10.1016/j.jns.2020.116808
  • 査読あり
• [雑誌論文] Epidemiological changes of acute encephalopathy in Japan based on national surveillance for 2014-2017 (2020)
  • 著者名/発表者名: Kasai Mariko、Shibata Akiko、Hoshino Ai、Maegaki Yoshihiro、Yamanouchi Hideo、Takanashi Jun-ichi、Yamagata Takanori、Sakuma Hiroshi、Okumura Akihisa、Nagase Hiroaki、Ishii Atsushi、Goto Tomohide、Oka Akira、Mizuguchi Masashi
  • 雑誌名: Brain and Development 巻: ー ページ: ー
  • DOI: 10.1016/j.braindev.2020.04.006
  • 査読あり
• [雑誌論文] 続編 てんかんを分かり易く理解するための神経科学 遺伝子変異 (2020)
  • 著者名/発表者名: 石井 敦士
  • 雑誌名: てんかん研究 巻: 37 ページ: 828～836
• [雑誌論文] Characteristics of KCNQ2 variants causing either benign neonatal epilepsy or developmental and epileptic encephalopathy (2019)
  • 著者名/発表者名: Goto Ayako、Ishii Atsushi、Shibata Mami、Ihara Yukiko、Cooper Edward C.、Hirose Shinichi
  • 雑誌名: Epilepsia 巻: 60 ページ: 1870～1880
  • DOI: 10.1111/epi.16314
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Copy number variation analysis in 83 children with early-onset developmental and epileptic encephalopathy after targeted resequencing of a 109-epilepsy gene panel (2019)
  • 著者名/発表者名: Hirabayashi Kyoko、Uehara Daniela Tiaki、Abe Hidetoshi、Ishii Atsushi、Moriyama Keiji、Hirose Shinichi、Inazawa Johji
  • 雑誌名: Journal of Human Genetics 巻: 64 ページ: 1097～1106
  • DOI: 10.1038/s10038-019-0661-x
  • 査読あり
• [雑誌論文] Heart rate variability in a patient with alternating hemiplegia (2019)
  • 著者名/発表者名: Nakashima Tsutomu、Yasuda Kanji、Kobayashi Makoto、Wada Hisayasu、Ishii Atsushi、Hirose Shinichi
  • 雑誌名: Intractable & Rare Diseases Research 巻: 8 ページ: 134～137
  • DOI: 10.5582/irdr.2019.01060
  • 査読あり
• [雑誌論文] PRRT2 mutations in Japanese patients with benign infantile epilepsy and paroxysmal kinesigenic dyskinesia (2019)
  • 著者名/発表者名: Okumura Akihisa、Shimojima Keiko、Kurahashi Hirokazu、Numoto Shingo、Shimada Shino、Ishii Atsushi、Ohmori Iori、Takahashi Satoru、Awaya Tomonari、Kubota Tetsuo、Sakakibara Takafumi、Ishihara Naoko、Hattori Ayako、Torisu Hiroyuki、Tohyama Jun、Inoue Takeshi、et al.
  • 雑誌名: Seizure 巻: 71 ページ: 1～5
  • DOI: 10.1016/j.seizure.2019.05.017
  • 査読あり
• [雑誌論文] Different types of suppression-burst patterns in patients with epilepsy of infancy with migrating focal seizures (EIMFS) (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshitomi Shinsaku、Takahashi Yukitoshi、Imai Katsumi、Koshimizu Eriko、Miyatake Satoko、Nakashima Mitsuko、Saitsu Hirotomo、Matsumoto Naomichi、Kato Mitsuhiro、Fujita Takako、Ishii Atsushi、Hirose Shinichi、Inoue Yushi
  • 雑誌名: Seizure 巻: 65 ページ: 118～123
  • DOI: 10.1016/j.seizure.2019.01.009
  • 査読あり
• [雑誌論文] Corrigendum to “Efficacy and tolerability of perampanel in pediatric patients with Dravet syndrome” [Epilepsy Res. 154 (2019) 34?38] (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshitomi Shinsaku、Takahashi Yukitoshi、Yamaguchi Tokito、Imai Katsumi、Ishii Atsushi、Hirose Shinichi、Inoue Yushi
  • 雑誌名: Epilepsy Research 巻: 156 ページ: 106158～106158
  • DOI: 10.1016/j.eplepsyres.2019.106158
  • 査読あり
• [雑誌論文] Efficacy and tolerability of perampanel in pediatric patients with Dravet syndrome (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshitomi Shinsaku、Takahashi Yukitoshi、Yamaguchi Tokito、Imai Katsumi、Ishii Atsushi、Hirose Shinichi、Inoue Yushi
  • 雑誌名: Epilepsy Research 巻: 154 ページ: 34～38
  • DOI: 10.1016/j.eplepsyres.2019.02.014
  • 査読あり
• [雑誌論文] Quinidine therapy and therapeutic drug monitoring in four patients with KCNT1 mutations (2019)
  • 著者名/発表者名: Yoshitomi, Shinsaku Takahashi, Yukitoshi Yamaguchi, Tokito Oboshi, Taikan Horino, Asako Ikeda, Hiroko Imai, Katsumi Okanishi, Tohru Nakashima, Mitsuko Saitsu, Hirotomo Matsumoto, Naomichi Yoshimoto, Jun Fujita, Takako Ishii, Atsushi Hirose, Shinichi Inoue, Yushi
  • 雑誌名: Epileptic Disord 巻: 21 ページ: 48～54
  • DOI: 10.1684/epd.2019.1026
  • 査読あり
• [雑誌論文] 【小児神経難病の臨床】Dravet症候群 (2019)
  • 著者名/発表者名: 石井 敦士
  • 雑誌名: 小児科 巻: 60 ページ: 941～947
• [学会発表] てんかんの遺伝子研究と日常診療での役立ち (2020)
  • 著者名/発表者名: 石井 敦士
  • 学会等名: 日本てんかん学会中国四国地方会
  • 招待講演
• [学会発表] Dravet症候群における発熱時および平熱時の免疫学的反応の解析 (2019)
  • 著者名/発表者名: 倉橋 宏和, 沼本 真吾, 奥村 彰久, 石井 敦士, 廣瀬 伸一
  • 学会等名: 第53回日本てんかん学会学術集会
• [学会発表] 基礎研究からさぐるてんかん病態: 臨床に役立つ知見 てんかんの遺伝子研究 (2019)
  • 著者名/発表者名: 石井 敦士
  • 学会等名: 第53回日本てんかん学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] てんかんと遺伝子 てんかん遺伝子情報の解釈の問題点 (2019)
  • 著者名/発表者名: 石井 敦士
  • 学会等名: 第53回日本てんかん学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] カルバマゼピンによる治療が有効であったKCNQ2-related neonatal epilepsyの1例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 竹内 章人, 廣瀬 伸一, 森本 大作, 中村 信, 影山 操, 石井 敦士
  • 学会等名: 第64回 日本新生児成育医学会・学術集会
• [学会発表] KCNA2遺伝子変異に伴うてんかん性脳症の1男児例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 重田 英臣, 福田 智文, 柴原 淳平, 五十嵐 亮太, 石井 雅宏, 楠原 浩一, 石井 敦士, 廣瀬 伸一
  • 学会等名: 第122回日本小児科学会学術集会
• [学会発表] 遊走性焦点発作を伴う乳児てんかんにおける発作抑制期間と発達予後の関連 (2019)
  • 著者名/発表者名: 野村 敏大, 本橋 裕子, 石山 昭彦, 竹下 絵里, 齋藤 貴志, 小牧 宏文, 中川 栄二, 須貝 研司, 才津 浩智, 藤田 京志, 松本 直通, 石井 敦士, 廣瀬 伸一, 佐々木 征行
  • 学会等名: 第61回日本小児神経学会学術集会
• [学会発表] HCN1遺伝子バリアントの早期乳児てんかん性脳症の1例 (2019)
  • 著者名/発表者名: 久保田 弘樹, 矢野 珠巨, 高橋 勉, 石井 敦士, 柴田 磨己, 廣瀬 伸一
  • 学会等名: 第61回日本小児神経学会学術集会
• [学会発表] PCDH19遺伝子関連てんかん3症例の臨床的特徴 (2019)
  • 著者名/発表者名: 田辺 仁彦, 林田 拓也, 戸川 雅美, 西村 洋子, 三浦 明彦, 石井 敦士, 前垣 義弘
  • 学会等名: 第61回日本小児神経学会学術集会
• [学会発表] Regional specificity of KCNQ2 missense variants causing benign or epileptic encephalopathy phenotype. (2019)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Ishii, Ayako Goto, Mami Shibata, Yukiko Ihara, Shinichi Hirose
  • 学会等名: 33rd International Epilepsy Congress
  • 国際学会
• [学会発表] Genetic etiology of neonatal epilepsiesby causes other than abnormalities of sodium ion channels (2019)
  • 著者名/発表者名: Atsushi Ishii
  • 学会等名: 20th Annual Meeting of Infantile Seizure Society
  • 国際学会
• [学会発表] てんかんの遺伝子研究の進歩 (2019)
  • 著者名/発表者名: 石井 敦士
  • 学会等名: 506回小児科学会福岡地方会
  • 招待講演
• [学会発表] てんかんのPrecision medicineの基盤となる遺伝子研究 (2019)
  • 著者名/発表者名: 石井 敦士
  • 学会等名: 第52回日本てんかん学会学術集会記念シンポジウム
  • 招待講演