| 研究課題/領域番号 |
19K17402
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
藤森 尚 九州大学, 大学病院, 助教 (60808137)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 膵癌 / liquid biopsy / cell-free DNA / 網羅的遺伝子発現解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は膵癌患者の末梢血中のcell-free DNA（cfDNA）を前向きに追跡することで、liquid biopsyの有用性を評価することを主な目的とする。実際には患者サンプルの取得に始まり、血漿からのcfDNA抽出、ライブラリー作成と網羅的遺伝子発現解析、更に診断時の組織サンプル（EUS-FNA検体や外科切除検体）との遺伝子発現の比較を患者毎に経時的に行う研究計画である。初年度に、当院倫理委員会の承認を得た後、実際の膵癌患者における血漿サンプル保存を前向きに開始した。研究計画通り、そこからcfDNA抽出・ライブラリー作成を開始し、本年度も継続した。更にサンプルを選定した上で、cfDNA由来の網羅的遺伝子発現解析（cfDNA-seq）を実施した。
具体的には、2021年3月までの期間に膵癌患者16症例から血漿（計51サンプル）を採取し、その中の11症例から治療前のcfDNAを抽出した。更にその内8症例で化学療法導入後のサンプルが採取でき、cfDNAの経時的変化を評価しえた。結果として、8例中6例（75%）で化学療法導入後にcfDNA濃度が上昇しており、cfDNAの経時的変化を追うことの有用性が示唆された。経時的変化の詳細を明らかにするために、術後再発症例を抽出して、次世代シーケンサーを用いたcfDNA-seqを行った。臨床的に有用な遺伝子バリアントが存在するか、またそれが経時的に変化する傾向があるかを把握するために、代表的ながん遺伝子パネル検査であるFoundationOneの遺伝子群（324遺伝子）を用いたターゲットシークエンスと対比した。その結果、ALK、BCL2L2、FGFR4など一部の遺伝子変異が症例や治療前後に問わず一致することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
研究実績の概要へ記載した通り、前向きの患者登録・サンプル集積と症例を選んでcfDNA-seqを実施した。概ね研究計画書通りの進捗であり、本年度はcfDNA-seqの結果を重点的に解析した。その結果、liquid biopsyの真の有用性を評価するためには、膵癌術後組織での遺伝子発現との比較解析が必要不可欠と判断した。そこで、サンプル集積の対象症例を膵癌術後組織が確実に得られる術後再発症例に絞る方針へ変更した。対象者を絞ることで、均一な条件のサンプルが得られる一方、患者（サンプル）集積に時間を要する結果となった。また、術後の保存組織は非常に稀少であり、十分量のDNA抽出ができるかの予備検討にも時間を要した。
上記を総合して、「やや遅れている。」とした。
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| 今後の研究の推進方策 |
Liquid biopsyの有用性を考える上で、膵癌組織における遺伝子変異が末梢血中（cfDNA）の遺伝子変異としてどこまで保たれているか、を評価することが重要である。そこでcfDNA-seqを行った症例の中から、膵癌術後再発症例を選定し、膵癌術後組織由来の網羅的遺伝子変異解析（DNA-seq）とcfDNA-seqの比較解析を行う方針である。網羅的解析にかかる研究費の問題、及びシークエンスのqualityを担保する必要性から、一検体毎の評価は困難であり一定のサンプル数が確保された時点で解析する方針である。
現在までに、術後再発組織からのDNA-seqが終了しており、今後バイオインフォマティクスの手法を用いてcfDNA-seqとの比較解析（個別の遺伝子比較、及びパスウェイ解析）を行う。更に、得られた遺伝子変異の情報が、保存サンプルに応用可能かを評価する予定である（validation study）。遺伝子変異の絞り込みができた時点で、保存サンプルからもcfDNAを抽出し、遺伝子変異の経時的変化をコンパニオン診断的に解析すると共に、臨床因子との比較解析を予定している。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた主な理由は、まとまったサンプル数を確保すること及び術後再発症例の選定に時間を要した点である。cfDNAの経時的変化を適切に評価するためには、治療前と病勢増悪時のサンプル取得が必要であり、各症例で半年～1年単位の経過観察期間が必要である。また、網羅的解析にかかる研究費やシーケンスのqualityの問題から、一検体毎の評価は困難であり、一定のサンプル数が確保された時点（12検体）で実際の解析を行った。今後の研究の推進方策で記述したように、cfDNA-seqと術後組織のDNA-seqを比較解析している最中であり、その結果を受けて次年度に保存サンプルのcfDNA-seqやターゲットシークエンスへ展開する予定である。上記経緯にて次年度使用額として支出する方が、研究全体から考えた際に有益と判断した。
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