尿を用いた非侵襲性肝細胞がん腫瘍マーカーの開発 ビクニン上の糖鎖構造を標的として

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 19K17445
• 研究機関: 愛知医科大学
• 研究代表者: 土本 純 愛知医科大学, 付置研究所, 助教 (70632868)
• 研究期間 (年度): 2019-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 肝細胞がん / 腫瘍マーカー / 糖鎖 / コンドロイチン硫酸 / ビクニン

研究実績の概要

肝細胞がんは早期発見によって５年生存率が50%以上上昇する。一方で、高危険群への定期的な診察を行っている日本であっても、早期発見は60%にとどまる。そこで，本研究では肝細胞由来タンパク質であるビクニン上のコンドロイチン硫酸鎖を標的とした、非侵襲性尿中肝細胞がん腫瘍マーカーを開発することを目標としている。本研究は、肝細胞がんの早期発見に貢献するだけでなく，採血が不要となるため、より安全な検査方法を提案できると考えている。
2019年度での患者試料を用いた研究では，わずかに違いはあるものの有意差が得られなかった。そのため，より多くの試料の解析が必要であるが，新型コロナウイルス感染症の流行のため，患者試料の収集を中止しており，患者試料を用いた研究の遂行はできていない。
そこで，2020年度は患者試料を用いた研究ではなく，培養細胞系を用いた研究を行った。これまでの予備的研究において，肝細胞がん由来の培養細胞株が産生するビクニン上のコンドロイチン硫酸は健常人由来のビクニン上コンドロイチン硫酸とは組成が異なることが分かっている。そこで，iPS細胞を肝細胞へと分化させ，iPS細胞由来正常肝細胞と肝細胞がん由来細胞株のコンドロイチン硫酸合成に関与する酵素群の発現量の比較解析を進めている。コンドロイチン硫酸合成に関与する酵素群に対する抗体の整備が不十分なため，質量分析計を用いた発現量の比較解析を予定している。現在は予備実験として，数種類の組み換え酵素を用いて，どのようなペプチドを標的に測定を行うのがよいのかを検討している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

患者試料を用いた研究は遂行できていないが，培養細胞を用いた研究へと移行したため進展している。iPS細胞から肝細胞への分化は申請者の所属する研究室ですでに行われており，また申請者は質量分析計を用いた研究経験があるため，現在の計画に技術的問題は無い。

今後の研究の推進方策

質量分析計を用いたタンパク質の定量において，測定の標的とする各タンパク質に特異的なペプチドの選択が非常に重要である。イオン化効率が良く，翻訳後修飾を受けないペプチドのスクリーニングを現在行っており，標的ペプチドの選択を進める。現在は組み換えタンパク質を用いて行っているが，一定の傾向を見いだせれば，既存のプロテオミクスデータベースを活用し，標的ペプチドを決定する。標的ペプチドを決定できれば，iPS細胞由来肝細胞と肝細胞がん由来細胞株のコンドロイチン硫酸合成に関与する酵素群の発現量を比較解析する。

次年度使用額が生じた理由

2019年度未使用額が309,665円あり，新型コロナウイルス感染症の流行により，研究計画を大幅に見直し，培養細胞を用いた研究へと移行したため，160,904円の未使用額が生じた。2021年度ではiPS細胞からの肝細胞分化を行うための試薬の購入や，質量分析計を用いたタンパク質の発現解析に用いる内部標準の調製費用として使用する予定である。