| 研究課題/領域番号 |
19K17537
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| 研究機関 | 慶應義塾大学 |
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研究代表者 |
橋本 寿之 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (90528390)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 再生医療 / 心臓発生 / 心筋分化 / リプログラミング / 転写因子 |
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| 研究実績の概要 |
心血管疾患は世界において死亡原因の第一位であり、その要因の一つは心臓に十分な自己再生能がない事である。また、心臓発生の転写制御ネットワークに関しては未だ不明な点が多く、現存する医療技術では未だに心臓を創り出し、有効に再生して修復する事ができていない。
現在、心臓形成の分子メカニズムを研究するにはヒトと同じ哺乳類であるマウスを用いることが主流であるが、多くの費用と時間を要する。このような中、我々は線維芽細胞から心筋細胞を直接誘導するダイレクトリプログラミングという手法に着目し、細胞のみを用いるこの系がマウスに代わる心臓形成の分子メカニズムを研究するツールとなりうるのではないかと考えた。この仮説を立証するため、申請者は転写因子Zinc Finger Protein 281(ZNF281)に着目した。申請者はZNF281には線維芽細胞を心筋様細胞に誘導する効率を著明に改善する作用があることを最近明らかにしたが、ZNF281の心臓発生における機能は不明である。
本研究ではこのZNF281の心筋誘導作用に着目し、胚性幹（ES）細胞及びマウスを用いて心筋分化と心臓発生におけるZNF281の転写調節機構と作用を解明する事を目標とする。本研究成果はZNF281を利用した新たな心臓再生技術の開発につながる可能性があるだけでなく、心臓形成に関わる新規制御因子を探索するデータベースとしてのリプログラミング法の新たな利用価値を立証することとなる。
初年度はマウスES細胞でZNF281を薬剤により誘導的に過剰発現できるES細胞ラインの樹立に成功した。現在この細胞を用いて過剰なZNF281は心筋分化を促進するのかを検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
初年度はTet-On発現誘導システムを用いてマウスES細胞でZNF281を誘導的に過剰発現できるES細胞ラインの樹立に成功した。しかしCRISPR/Cas9を用いた条件付きでZNF281をノックアウト(KO)できるZNF281 floxed ES細胞ラインの樹立が技術的に困難であり、単純にZNF281をKOしたES細胞ラインの樹立へと切り替えたため、予定より計画がやや遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度は初年度に計画していた、上記ES細胞ラインを利用して各分化段階でZNF281の発現量を調整し、免疫染色法と定量PCR(qPCR)法等を用いて心筋分化効率、心筋細胞の形態、機能を評価する。これにより、ZNF281は心筋分化に必須の転写因子なのか、そして過剰なZNF281は心筋分化を促進するのかを分化段階毎に明らかにする。また、トランスクリプトーム解析を行い、ZNF281がどのような転写ネットワークを介して心筋分化を調節しているかを明らかにする。
また、ZNF281をクローニングしたTet-On発現誘導ベクターを用いてトランスジェニックマウスを作成し、Myh6プロモーター下でreverse tetracycline transactivator (rtTA)を発現するトランスジェニックマウスと交配することにより、ドキシサイクリンの投与下で心筋特異的にZNF281を発現するマウスラインを樹立する。このマウスを用いて心筋特異的にZNF281を過剰発現し、マウス心臓の表現型を解析する。これらの解析により、過剰なZNF281の発現が心臓の発生において構造的、機能的、遺伝子プロファイル等にどのような影響を与えるかを明らかにする。
そして本年度中にZNF281 floxedマウスラインの樹立を目指す。そのためにはCRISPR/Cas9を用いて、受精卵においてZNF281のコーディング領域(CDS)を挟む形で二つのloxP配列をノックインする予定で、すでにfounder line (F0)は誕生しており、今後genotypingを経て目的のラインを選別する予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
上記の通り、研究計画を変更したために計画がやや遅れており、使用する試薬や物品が翌年度に繰り越しとなった。
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