| 研究課題/領域番号 |
19K17552
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| 研究機関 | 金沢大学 |
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研究代表者 |
岡田 寛史 金沢大学, 附属病院, 特任助教 (10735161)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | iPS細胞 / 家族性高コレステロール血症 |
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| 研究実績の概要 |
予定している検討課題としては、遺伝子修正iPS細胞を由来とする機能細胞に対するin vivoでの機能評価であり、具体的にはLDL受容体ノックアウトマウスを使用した生体内でのLDL受容体機能に関する評価が挙げられる。また、これに付随してアポ蛋白の異常などについても評価を行い、細胞移植片による高LDLコレステロール血症の改善もしくは動脈硬化の進行抑制が可能かどうかについて検討する予定である。今年度は、主にゲノム編集後の機能細胞への分化誘導方法の見直しと実験動物への細胞移植方法の検討を行った。これまで、疾患iPS細胞に対するゲノム編集後、機能細胞への分化誘導及びその確認として、疾患由来iPS細胞を各種サイトカインとともに培養することで、誘導機能細胞への分化を行っていた。この際に、未分化細胞混入率を低下させることが報告されている方法を参考にコーティング法を変更し、分化細胞を純化する方法を検討した。また、in vitroでの造腫瘍性評価としての軟寒天培養を行った。軟寒天コロニー形成試験では、iPS細胞由来肝細胞では足場非依存的な増殖は見られなかったが、iPS細胞においても同様にコロニー形成は見られず、未分化もしくは悪性形質転換したiPS細胞の混入を検出する目的では、既報の如く本試験は適さない可能性が考えられ、qRT-PCRでの遺伝子発現解析による評価と免疫不全マウスに対する移植といったvivoでの評価が必要と考えられた。その他、実験動物への細胞移植方法の検討に使用するHepG2細胞に対するゲノム編集を行い、動物実験を行う準備を進めた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ゲノム編集を行ったHepG2細胞株を用いて、ノックアウトマウスに対する移植実験を行い、生着率の良い方法を採用する予定であるが、実験動物搬入の手続き、必要とする匹数の確保に時間を要しているため、やや遅れている状況である。
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| 今後の研究の推進方策 |
実験動物の準備に時間を要しているが、用意出来次第、以下の検討を行う予定としている。
誘導肝細胞の移植方法の検討として、HepG2細胞株を用いてマウスへの直接シート状細胞を肝臓表面に移植する方法や脾臓内もしくは上腸間膜静脈への注入など様々な方法に関して検討を行い、生着の良い方法を採用する。また、採用した方法を用いて誘導肝細胞をマウスへの移植を行い、高脂肪食を与え飼育しながら、血清LDLコレステロール値に対する降下作用及びリポタンパクを含めた詳細な脂質プロファイルを評価する。また、ラジオアイソトープを用いた実験を行い、生体内でのLDL取り込みについて詳細に評価する。
また、前述の通り、iPS細胞を由来とする機能細胞の移植における安全性評価としては、軟寒天コロニー形成試験では評価が不十分であることが考えられるため、移植マウスにおけるテラトーマ形成の有無、細胞移植片に対する遺伝子発現解析などを行い、安全性に関して評価を行う。
移植細胞の長期生着率および動脈硬化に関する評価としては、移植後マウスを8～12週間程度高脂肪食で飼育後、大動脈や大動脈弁周囲の動脈硬化巣形成の有無および動脈硬化の定量評価を行い、非移植後マウスと比較することで動脈硬化進行抑制作用について検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
前述の如く実験動物の搬入手続きに時間を要したため、動物実験そのものに関わる費用が少なかったことと、国内の学会での発表の機会が少なく、海外学会での発表の機会がなかったため、旅費として支出を予定していた費用に関する支出が無かったたことが理由として挙げられる。
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