| 研究実績の概要 |
去年度に引き続き、以下の培養細胞実験結果の確かさを確認するため、さらに追加実験を施行した。
LPS投与、及び糖濃度の異なる培養液による共培養実験系において、分化単球系THP-1細胞、ヒトMacrophageの細胞内小胞体ストレス、アポトーシス発現、及びその上流の細胞内情報伝達系変化と好中球やNETsを貪食する機能（Efferocytosis）の変化、及び培養液中のcfDNA量を解析した。具体的には以下の項目で、変化が得られた。統計的な有意差があるのか、今後検討していく。a.貪食能（Efferocytosis）蛍光Cell Trackerで標識後、PMA負荷した好中球及びNETsのマクロファージによる貪食能定量。（FCM法）b.培養液中のcfDNA量測定 cfDNA濃縮用に設計され、血清や血漿などの生体サンプルに最適化されているキットを用いて、リアルタイム PCR、次世代シーケンシングを含む広範な用途に適した高品質 DNA を高く回収し、DNAを定量評価。c. mitochondorial DNA、nuclearDNAを定量 リアルタイムPCR法 d. NETsの半定量 ヒストンHI、好中球エラスターゼ、DAPIの３重染色 e. 細胞内小胞体ストレス変化 細胞内CHOP、BiP発現変化（Western Blotting法、フローサイトメトリー(FCM)法) f. 細胞内Akt, p38MAPKリン酸化/Total(比)変化の定量（WesternBlot法、FCM法）。g. 細胞内ミトコンドリア膜電位変化の定量（JC-1、FCM法）h. 細胞内Bcl-2ファミリータンパク質発現の変化 Bcl-xl、Bcl-2/Bax、Bak比の解析（Western Blotting法、FCM法）i.細胞内カスパーゼ発現の変化Caspase 3, 9（FCM、WesternBlot法、免疫染色法）
また次世代シーケンサーを用いたmRNA発現の網羅的解析をするため、実験施行会社に外注を依頼した。
|
