2019 年度実施状況報告書

TCRレパトア解析を用いた膠芽腫特異抗原の探索と新規免疫療法への応用

研究課題

研究課題/領域番号	19K18403
研究機関	慶應義塾大学
研究代表者	嵯峨伊佐子慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 共同研究員 (50445219)
研究期間 (年度)	2019-04-01 – 2021-03-31
キーワード	T細胞受容体 / グリオーマ / 免疫療法 / 脳腫瘍
研究実績の概要	膠芽腫は、外科的療法、放射線療法、化学療法、分子標的療法などの集学的治療をもってしても、決定的な治療用法のない、非常に予後の悪い腫瘍である。決定的な治療法の確立が急がれる中、注目を集めているのが、免疫療法である。悪性腫瘍に対する免疫療法には、悪性腫瘍が免疫系による攻撃を回避する能力を抑制する治療法と、悪性腫瘍に対する免疫反応を増強する治療法の2つの側面がある。多くのがん種において劇的な治療効果を発揮し、脚光を浴びるようになった免疫チェックポイント阻害剤は、前者である。しかし、膠芽腫に対する臨床試験の結果は、必ずしも芳しくない。膠芽腫に対する免疫療法を考える上では、①中枢神経系という免疫寛容な環境、②免疫療法に有効な患者群の判別・治療効果判定のためのバイオマーカーの存在、③治療の相乗効果のための免疫併用療法の重要性が示唆される。我々は、悪性腫瘍に対する免疫反応を増強する免疫療法のひとつであるがんペプチドワクチンの臨床研究をすすめ、膠芽腫の腫瘍検体を対象とした次世代T細胞受容体（T Cell Receptor : TCR）レパトア解析によって、腫瘍細胞表面に発現する抗原と、浸潤するT細胞の解析を行った。その結果、膠芽腫腫瘍検体では、TCRの多様性が低下していること、また、臨床経過の良好な症例に、Diversity Indexが低い傾向が示唆されることを発見した。現在は、膠芽腫浸潤T細胞のサブセット解析を加え、臨床情報とのより精密な相関を検討している。さらに、末梢血におけるTCRレパトア解析を行い、被験者の免疫応答を非侵襲的にモニタリングし得るバイオマーカーの開発へ向けての準備を進めている。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由 1）膠芽腫組織に浸潤するT細胞のサブタイプ解析手術症例で得た膠芽腫切片を、HE染色、免疫染色（CD3, CD4, CD8）で評価した。CD4+, CD8+ T細胞の割合とPFS（progression-free survival）, OS（Overall Survival）などの臨床学的背景との相関を、単変量・多変量解析にて比較している。 2）次世代シークエンシング法による膠芽腫細胞TCRレパトア解析腫瘍細胞および神経膠腫被験者の血清を対象とし、TCRレパトア解析結果を検証、治療標的となる膠芽腫抗原特異的Ｔ細胞の探索を行っている。
今後の研究の推進方策	膠芽腫切片における、CD4+CD25+制御性T細胞の割合を評価するため、腫瘍浸潤性リンパ球（Tumor infiltrating lymphocytes : TIL）の免疫染色（CD45RO, FOXP3, PD1, PD-L1, HLA）を行う。令和元年度に得られた所見に加え、臨床学的背景との相関を検討する。TILが乏しい群、CD8+T細胞の浸潤が高度にみられる群、FOXP3発現が高い群にグループ化し、膠芽腫検体より抽出されたmRNAを用いてリアルタイムPCR、各グループ間でのマイクロアレイ解析による比較を行う。膠芽腫幹細胞マウスモデルを用いて、ペプチドワクチンと免疫チェックポイント阻害剤との複合免疫療法の有効性を検証する。同定された腫瘍抗原投与法の最適化を行うため、腫瘍抗原ペプチドワクチンを投与後、一定期間後にCTL 解析を行い、最も有効なワクチンの投与法を決定する。次に、膠芽腫幹細胞マウスモデルを用いて、新規ペプチドワクチンと免疫チェックポイント阻害剤（抗PD-1抗体、抗PD-L1 抗体、抗CTLA-4抗体など）併用投与後のCTL解析、生存期間より治療効果を検証する。
次年度使用額が生じた理由	研究継続のため、下記消耗品の購入費を要する。免疫染色に用いる抗体（CD3, CD4, CD8, CD45RO, FOXP3, PD1, PD-L1, HLA など）、膠芽腫幹細胞の培養に必要な培地・試薬（Neuro Basal Medium, B27, ヒトEGF, ヒトFGF, ヒトLIFなど）、スライドグラス・プラスチック・ガラス容器・保管培養に用いるフラスコなど、動物実験として、C57BL/6マウスの購入・当研究室で飼育のために用いる餌や床など。