| 研究課題/領域番号 |
19K18482
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| 研究機関 | 医療法人徳洲会野崎徳洲会病院(附属研究所) |
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研究代表者 |
熊井 準 医療法人徳洲会野崎徳洲会病院(附属研究所), 研究所, 研究員 (20826549)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | がん / がん転移 / ECM / 硬さ |
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| 研究実績の概要 |
がんの転移は、原発巣から周囲組織への浸潤、血管内への侵入、血中での生存、転移組織への侵入、生着など複数のステップから成る。血中での生存と転移先組織での生着は、免疫監視からの回避メカニズムが明らかになるなど近年注目され、転移の成立において重要なステップである。そこで、転移先臓器での生着過程で、転移先組織の硬さへの細胞の適応性ががんの転移に与える影響に着目し、抗転移療法への応用を目指した基礎データ取得を目指している。ECMの硬度に対する細胞の適応性を評価する基材として新規硬度可変型ポリアクリルアミド（PA）ゲルの調整方法を開発した。従来はタンパク質架橋剤としてsulfo-SANPAHをPAゲルに結合させ、硬度に対する細胞応答を評価してきたが、sulfo-SANPAHは非常に高価で不安定、溶解性も悪いなど様々な欠点を有する。さらに、アクリルアミド（AA）の重合後に、sulfo-SANPAHを結合させるため作業工程が多くなってしまう。これらの欠点を解決し、簡便なPAゲルシステムを構築するために、安価なNHS-AAエステルをタンパク質架橋剤として用い、ゲル作製時に同時に混合することで、安価で簡便な作業工程で調整可能な新規PAゲルを開発し論文を投稿した。この論文は、Frontiers in materials誌に掲載された。そして、現在は、このPAゲル実験系を用いて上皮系細胞の肺転移形成メカニズムをがんの生着段階から探ることを目指して実験をしている。細胞を軟らかい環境下で繰り返し培養することで軟らかい環境になれた群となれない群で細胞の表現系の違いを比較している。がんの転移能の強さでがん細胞の生着段階に差がありそうなデータを取得している。そして詳細な分子メカニズム解析を進めている段階である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究における鍵となる実験系を開発した。これは本研究の大きな前進であることは間違いない。従来タンパク質架橋剤としてsulfo-SANPAHをPAゲルに結合し、硬度に対する細胞応答を評価してきたが、sulfo-SANPAHは非常に高価で様々な欠点を有する。これらの欠点を解決し、簡便なPAゲルシステムを構築するために、安価なNHS-AAエステルをタンパク質架橋剤として用い、ゲル作製時に同時に混合することで、安価で簡便な作業工程で調整可能な新規PAゲルを開発した。さらに、この基材を用いて骨肉腫の原発株であるDunnと高転移株であるLM8の細胞増殖と形態を確認したところECMの硬さが硬くなるにつれて増殖能と細胞伸展能が増強することが示された。また、LM8はDunnと比較してより強い生物活性を示した。これらの知見は、骨肉腫の転移過程においてECMの硬さが転移の形成を促進することが示唆できる。骨肉腫で細胞外環境の硬さに対する反応性をまとめたデータを現在発表準備中である。さらに、様々な上皮系のがん細胞を用いて、軟らかいPAゲル上で細胞を繰り返し培養し軟らかい環境にどの様に細胞がなれていく過程を解析中である。転移能が高いMDA-MB-231（乳がん）とPC3細胞（前立腺がん）は、軟らかい環境で継代を繰り返すことで増殖能や細胞伸展能が増強することが示された。さらに、これらの細胞のRNA-Seqデータを解析するとこれら二つの細胞は同様のクラスターに分類されることが示された。これらの事柄から実験は概ね順調に進んでいると考えられる。また、この実験結果から新しいアイデアも生まれており様々な知見が得られると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
乳がんでなぜ細胞外環境の硬さを標的にした治療がうまくいかないかを検証し、骨肉腫と比較することで骨肉腫での有用性を明らかにする。① Mechanical memoryの解明：プラスチック培養基材に適応している細胞を、乳腺相当の硬さ（1 kPa）に再適応させ、その過程を継時的に評価する。細胞応答の違いは、細胞増殖・運動能・細胞形態という観点から評価を行う。さらに、YAP/TAZなどのMechanical memory関連因子をターゲットとしてこれらの発現を継時的に比較する。そして、再適応していく過程でMechanical memory関連因子がどのように再適応過程を制御しているのかを明らかにする。②RNA-Seqデータ解析を行う。継代１回目から３回目の細胞のRNAデータを解析し、適応過程で鍵となる分子を探索する。この鍵となる分子に変異などを加えて軟らかい環境への適応メカニズムを探る。③ 鍵となる分子のメカニズムを解明後、その分子が実際に生体内での転移形成に鍵となるかをマウスモデルを用いて明らかにする。そして、細胞外環境の硬さへの適応性を制御する因子を標的とした薬剤を評価し、新規抗転移療法を確立することを目指す。
また、当初より予定していた3D培養下での空間の影響を評価するため、現在新たな実験系を構築しており、予備検討が順調に進んでいる。今後は、この実験系を用いて3D培養下での空間の重要性や空間を含めた環境下での新たな転移メカニズムの解明や新規治療標的の探索に取り組んでいきたい。さらに、骨肉腫で細胞外環境の硬さに対する反応性をまとめたデータを現在発表準備中である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
RNA-seq解析を予定しており、大きな金額がかかってくるため繰越金額が大きくなっている。
実験計画的に大きな変更はなく。従来通りの計画で実験を行う。
また、今年度はコロナ禍で思う様に学会に参加できなかったことも大きく影響している。
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