| 研究課題/領域番号 |
19K18495
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
出田 宏和 信州大学, 医学部附属病院, 医員 (00838534)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 骨芽細胞 / カーボンナノホーン / 骨粗鬆症 |
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| 研究実績の概要 |
我々はカーボンナノホーン（CNH）を暴露したMC3T3-E1マウス前骨芽細胞で骨芽細胞の分化マーカー遺伝子の発現が増加する現象を捉えた。この細胞分化誘導は何らかのレセプターを介している事が予想されることから、我々はこのレセプターを介する新たな骨芽細胞を標的とする骨形成促進薬の開発を目的としている。本申請ではこのレセプター、およびその初動遺伝子を明らかにし、骨形成促進のための分子標的薬開発のためのターゲット分子の特定を目指している。
令和元年度はこのMC3T3-E1マウス前骨芽細胞とCNHで見られた現象の再現性、石灰化処理をした場合の影響、仔マウス頭蓋骨から採取した初代培養骨芽細胞でも同様の現象がみられるかをALP活性、アリザリンレッド染色、そして骨芽細胞のマーカー遺伝子や細胞分化マーカー遺伝子の発現を指標にして研究を行った。なお、このCNHによるMC3T3-E1細胞における分化マーカーの発現促進作用については第34回日本整形外科学会基礎学術集会で報告している。
また、上述したMC3T3-E1マウス前骨芽細胞を使った実験において再現性の不安定性が見られたことから、MC3T3-E1マウス前骨芽細胞を使った骨形成評価についての検討も行う事にした。なぜなら、MC3T3-E1細胞は日本で樹立された骨芽細胞株であるが、受託機関が骨形成について評価を行う場合に使う最も代表的な細胞であり、この細胞を使った実験データの再現性に問題があると、骨系バイオマテリアル評価に多大な影響があるからである。実際、MC3T3-E1細胞で見られた現象はプライマリーの骨芽細胞では今のところ確認ができていない。一方でMC3T3-E1マウス前骨芽細胞でCNHは3日目まで顕微鏡下で取り込まれていない像であったが、１週間以上観察していると細胞内に凝集塊が見られるようになることが明らかになっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和元年度の実験の中心であったMC3T3-E1マウス前骨芽細胞によるCNHの再現性実験、および、プライマリー細胞を用いた評価もほぼ予定通り行った。その結果からの知見は非常に複雑であり、注意深く研究を行っている。
CNHのMC3T3-E1細胞による再現性実験はこれまでにすでに5回行っている。この実験は非常にシンプルであり、CNH暴露5日目に細胞を回収し、AlplとBglapの遺伝子発現変化を未処理細胞と比較した実験であるが、発現の上昇が見られた実験が2回、変化が見られなかったケースが３回である。さらに同じ細胞を石灰化培地条件下で行った場合のCNHの影響もこれまでのところ1回はアリザリン染色による石灰化評価で石灰化が促進している結果が得られたが、他の2回はほとんど効果が見られていない。ALP活性でも有意差がある結果は得られたが、1.5倍にも満たない変化であった。また、プライマリー細胞を使った実験では今のところ、CNHによる骨形成能に対する有効性は確認できていない。
このため、我々はCNHの効果がMC3T3-E1細胞だけのある特定条件で起きる現象かどうかの確認を進めている。もともとMC3T3-E1細胞は1980年代に日本で今回行っているプライマリー細胞と同様の方法で採取され、セルライン化された骨芽系細胞である。しかし、この細胞はアメリカに譲渡された後、培地条件が変更されている。さらに播種濃度や継代回数によってALP活性が変化することも報告されており、ちょっとした培養条件の違いが結果に大きな影響を与える可能性がある。そこで、培養条件の違いの影響を検討しており、その結果の一部として培地成分の違いによって細胞の増殖能、骨形成能が異なること、さらにその培地によってMC3T3-E1細胞だけでなく、プライマリー細胞でも細胞継代だけで遺伝子の発現パターンが異なってしまうことが明らかになっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
令和2年度は以下の3項目を同時に進行して研究を推進する。
・培養条件による骨芽系細胞の骨形成能評価への影響－培地、継代数、細胞の初期条件とCNHの組み合わせでCNHの骨形成能促進結果が得られる条件を明らかにする。
・CNHに対する骨芽細胞のレセプターの特定―上記の条件検討を行った上で、骨形成能の上昇する条件がCNHが細胞に取り込まれてから起きているのか、取り込まれる前の段階で起きるのかをエンドサイトーシスのインヒビターなどを用いて確認する。
・CNHによる骨形成促進効果のin vivo評価―CNHによる骨形成促進効果の有無について骨粗鬆症モデル動物を作製し、これに埋め込んで骨形成が促進するかの評価をスタートさせる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
実験消耗品が研究所が所有する物品でまかなえていたものが多数あった点があげられる。 また、細胞実験で再現が取れ次第、外注でのマイクロアレイの分析をする予定だったが、細胞実験の再現性に問題があったため、再現性の取れる条件検討を令和元年は行い、高額なマイクロアレイ分析は行わなかった。今年度、CNHの細胞分化マーカー発現上昇がみられる条件を特定した上で、もともと予定していたコントロール群との比較だけでなく、CNH暴露しても発現上昇の見られなかった群も含めてのマイクロアレイ分析を実施する予定であり、繰り越した助成金と合わせて、外注分析を依頼する。これによってより詳細なCNH刺激に関与する遺伝子群の特定が可能になると考えている。
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