| 研究課題/領域番号 |
19K18702
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
小柳 貴裕 自治医科大学, 医学部, 助教 (90742122)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 婦人科がん / バソヒビン２ / 微小管制御 / 細胞周期 / 血管新生 |
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| 研究実績の概要 |
バソヒビン2 (VASH2)はがん細胞特異的な血管新生促進因子であり、血管新生阻害療法にむけた基礎研究が進んでいる。近年VASH2は微小管重合に寄与するチュー
ブリン脱チロシン化作用（tubulin carboxypeptidase; TCP活性）を有することが海外より相次いで報告された。パクリタキセル（PTX）は微小管脱重合阻害剤であり、VASH2と何らかの相互作用を示す可能性がある。卵巣がん細胞株についてVASH2ノックアウト株を樹立し、PTXに対する薬剤感受性を検討した。
CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術によりVASH2をノックアウトした卵巣がん細胞株（SKOV-3、SHIN-3）を樹立した。VASH2ノックアウトは2次元培養における細胞の倍加時間に影響を与えず、また3次元培養の細胞集塊径にも有意差を認めなかった。細胞内のチューブリン脱チロシン化の状態をウエスタンブロッティングで確認したところ、VASH2ノックアウト株では、PTX曝露による脱チロシン化チューブリン発現の亢進が抑制された。次いで、WST-1アッセイで抗がん剤に対する薬剤感受性を評価したところ、VASH2ノックアウト株ではPTX感受性がコントロールに比べて有意に増強した。一方でシスプラチンについては薬剤感受性に差を認めなかった。さらに、VASH2ノックアウト株では細胞周期のM期中期のマーカーであるCyclin B1発現が増加しており、細胞周期がM期中期で停止している細胞の割合が増加してPTXに対する薬剤感受性が増強したと考えられた。
VASH2を標的とした婦人科がん治療戦略では、既知の血管新生阻害のみならずチューブリン脱チロシン化酵素活性に着目することで、抗がん剤感受性増強作用など、より多角的な視点から新たな分子標的治療の確立が期待できる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
卵巣がん細胞において、バソヒビン２（VASH2）をノックアウトした際の細胞内脱チロシン化チューブリン発現やパクリタキセル感受性について、in vitroでの検討を進めてきた。CRISPR/Cas9を用いたゲノム編集技術によりVASH2をノックアウトした卵巣がん細胞株（SKOV-3、SHIN-3）を樹立し、VASH2は細胞内の脱チロシン化チューブリン発現の亢進に寄与していること、これをノックアウトすることで脱チロシン化チューブリン発現が抑制され、PTXに対する薬剤感受性が有意に増強することを明らかにした。さらにその機序として、VASH2ノックアウト株ではCyclin B1発現が増加しており、細胞周期がM期中期で停止している細胞の割合が増加してPTXに対する薬剤感受性が増強したと考えられた。
現在上記のデータをまとめ、論文投稿中であり、本研究はおおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
VASH2をノックアウトしても完全には脱チロシン化チューブリン発現が消失せず、また細胞死にも至らないため、バソヒビンファミリー以外のTCP活性を有する因子が存在すると考えられる。この因子の同定の一助として、VASH2をノックアウトした際に発現変動する遺伝子をRNA sequenceにより網羅的に解析し、微小管活性・細胞分裂・細胞周期に関連する発現変動遺伝子を絞り込み同定する。その因子について、gain-of-function、loss-of-functionの実験を計画する。また、子宮頸がんや子宮体がんなど、他の婦人科がん細胞株についても同様の事象が認められるかを検討する。
さらに、担癌マウスを用いたin vivoの解析について、我々はVASH2に対する中和モノクローナル抗体をすでに樹立しているため、抗体による治療実験を行い、腫瘍内における微小管活性の評価、既存の抗がん剤との相乗効果について評価したい。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
物品購入についてはおおむね計画通りに予算を執行できた。旅費については、新型コロナウイルス感染拡大の影響を受け出張がすべてキャンセルとなったため、0円になった。一方で、Web学会参加費をその他の支出費目で計上した。また、論文作成・英文校正費用やRNA sequenceのデータ解析費用もその他の支出費目で計上したため、計画よりも支出が増加した。全体としての執行率は90.6％である。
次年度は引き続きWeb学会参加・発表を予定している。また、英論文の英文校正や論文掲載料での支出が見込まれる。物品購入についても計画的に予算を執行できるよう実験を進めている。
以上より、次年度使用額が生じたと考える。
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