| 研究課題/領域番号 |
19K18709
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| 研究機関 | 東海大学 |
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研究代表者 |
柏木 寛史 東海大学, 医学部, 助教 (10710460)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | 妊娠関連タンパク質 / Pregnancy zone protein / 自己抗体 / 抗胎児抗体 / 流産 / 妊娠免疫 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、実験１：PZPの血漿動態解析、実験２：PZPの機能解析の2本柱で計画した。
実験１に関しては、東海大学産婦人科産科外来を受診する妊婦のうち、同意を得られた妊婦から検体採取を行った。自己抗体・抗胎児抗体陽性の妊婦血漿と正常妊婦の血漿をそれぞれ採取し、PZP、ステロイドホルモンの血中濃度等の比較検討を進めている。自己抗体陽性妊婦でPZPが高値、妊娠高血圧症候群妊婦でPZPが低値を示す傾向を認めた。また分娩時の胎盤におけるPZPの発現に関しても比較実験データを集めている。
実験２に関しては、PZPのベイト領域における遺伝子変異の発生頻度をNCBIのSNP GeneViewツールを用いて解析したところ、ベイト領域にSNPが発生しやすいことが示唆された。また、ホモロジーモデリングによるPZPの3次構造解析を行ったところ、PZPのプロテアーゼインヒビターとしての機能の特異性が示唆されるものであった。これらの結果は、Human PZP and common marmoset A2ML1 as pregnancy related proteins. Scientific Reports. Mar 20;10(1):5088. doi: 10.1038/s41598-020-61714-8. 2020において論文発表を行った。
研究協力者の実験動物中央研究所において、ヒトPZPをCAGをプロモーターとして遺伝子導入したNOGマウスを作成し、全身でのPZPの発現を確認した。さらに、PZP発現NOGマウスにヒトPBMCを移植したヒト化マウスではPZP非発現NOGマウスと比較して肺、肝臓でヒトTリンパ球浸潤と組織破壊が抑制傾向にあることがわかった。これはPZPのプロテアーゼインヒビターとしての機能が組織への炎症性の細胞の浸潤を抑制することによるものであることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
PZPの血漿動態解析に関しては、妊娠中のPZPをELISAを用いて解析した。PZPは2nd trimesterをピークに非妊時の100倍以上に増加し、3rd trimesterを過ぎると緩やかに減少し、分娩後は速やかに非妊娠時レベルまで低下するという妊娠動態を示した。また胎盤絨毛管腔血を採取してPZPを測定したところ、妊婦血漿の10分の1程度まで減少していることが確認された。PZPは母体肝臓で大部分が産生され胎盤へ流入されていて、胎盤での産生は少量であることが示唆された。さらに、臍帯血中のPZPは非妊娠時レベルであり、胎盤での胎児側への流入がないことも示唆された。
さらに申請者は、PZP産生が免疫系に大きな影響を及ぼすステロイドホルモンと関連する可能性について解析を行うため、まず多くのステロイドホルモンの前駆体であり胎盤にて多量に産生されるプロゲステロンの定量を試みた。その結果、得られた検体の絨毛間腔血中プロゲステロン濃度は、生理的妊娠血漿濃度の10倍程度高値であった。プロゲステロンは免疫寛容に寄与することが報告されているが、胎盤でのトロフォブラストに対する免疫寛容にプロゲステロンが寄与している可能性が示唆された。
PZPの機能解析に関しては、PZPトランスジェニック(PZP Tg)NOGマウスを作製し、TgおよびLittermatesにヒト末梢血単核球(PBMC)の移植実験を行なった。PZP Tg NOGマウスでは、肺胞組織へのリンパ球の浸潤は遅延し、気管支周辺に集積すること、肝実質へのリンパ球浸潤も遅れることが示唆され、異種移植片に対する拒絶反応に関しては抑制する傾向があることが示唆された。また、これらのPZP Tg-NOGマウス(♂)をNOGマウス(♀)と交配し、妊娠率・出生率を確認した。その結果、数例の出産例はあるものの、妊娠が極めて起こりにくい傾向が示唆された。
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| 今後の研究の推進方策 |
PZP機能解析に関しては、上記のように過剰発現マウスでの出生率が低い傾向があることから、2021年度において、PZPの過剰発現が妊娠率に影響を及ぼすのかに関して妊娠実績データをさらに得て、検討する必要があると考えている。また、ベイト領域に変異のあるPZPのTgマウスを作成し、上記と同様にxeno移植の実験を行う予定である。現在所有するPZPトランスジェニックマウスに加えて、PZPノックダウンマウスまたはPZPノックアウトマウスを新たに作成し、PZP影響下での妊娠率の変化および各種マウス組織の変化を検討する必要があると考えている。
In vitroの実験に関して、時間のかかるPZP遺伝子改変マウスの作成を優先したため、2020年度までにin vitroの実験を行うことができなかった。2021年度はin vitroの実験系についても確立し、in vivoの実験系との整合性を確認する。まずは遺伝子コンストラクトを作製し、それをトランスフェクトしたHEK293あるいはHela細胞を培養してタンパク質を分泌させ、各種プロテアーゼ(セリンプロテアーゼ等)と反応させる。また、これらの培養上清と各種腫瘍細胞株を用いたtranswell migration assayを行う。プロテアーゼをゼラチナーゼB含有ゲル上で電気泳動し、タンパク質分解活性を測定する。これにより活性阻害を定量する。次に、プロテアーゼ結合部位を変異させたcDNAを遺伝子導入した細胞について同様の解析を行う。遺伝子コンストラクトの作成、ザイモグラフィー、transwell migration assay等の準備は整っており、2021年度に行う計画である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
2020年度に計画した実験に関して、Covid-19の影響により実験に必要なキットが年度内に納入されなかったため、実験を行うことができないものが発生した。また、実験動物中央研究所および東海大学研究支援センターに依頼して行う予定であった遺伝子改変マウス作製および次世代シークエンスに関しても、COVID-19の影響によりセンターの業務が縮小されたため、研究が進められなかった。そのため、692,460円の未使用額が発生した。2021年度においては、マウス作製に約300,000円、研究支援センターの使用料として約300,000円を繰り越し、2020年度内に完了できなかった実験を追加して行うことを計画している。
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