| 研究課題/領域番号 |
19K18767
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
西村 幸司 帝京大学, 医学部, 講師 (20405765)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | アデノ随伴ウイルスベクター / リプログラミング / オプトジェネティクス |
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| 研究実績の概要 |
In vivoでリプログラミングされた蝸牛神経細胞を光刺激し、機能の検証を試みている。具体的には、hSyn-Chronos-GFPベクターをアデノ随伴ウイルスに組み込み、神経細胞で光刺タンパクChronosが発現する実験系を立ち上げた。陽性対照として用いるべく内因性の蝸牛神経にIn vitroあるいはIn vivoで発現させた。用いたアデノ随伴ウイルスの血清型はAnc80とAAV2である。In vitroでは神経特異的なChronosの発現を確認した。さらに神経導入効率は100%に近いことを確認している。内因性の蝸牛神経の一部がレポーターGFPを発現し、Chronosの発現を確認した。In vivoでChronos導入後のモルモットの蝸牛鼓室階に光刺激ファイバーを挿入、光刺激しABR反応やCAPを測定したが蝸牛神経の活動のモニターには成功していない。光刺激条件（光刺激強度や刺激時間）を至適化している。シュワン細胞から神経細胞へのIn vivoリプログラミングに用いる遺伝子としてはAscl1とNeuroD1を用いており、遺伝子の導入方法としてはAAV2-CMVの下流に目的遺伝子を導入したアデノ随伴ウイルスベクターを作製して、マウスの後半規管から500 nl注入した。4週後の組織評価ではリプログラミング効率が低いため、バルプロ酸ナトリウムなどのリプログラミング促進因子の併用が必要と考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
内因性の蝸牛神経光刺激の実験系がまだ動いていないため。
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| 今後の研究の推進方策 |
蝸牛神経光刺激の実験系の改善策として、光刺激タンパク発現に用いているアデノ随伴ウイルスの濃縮を試み、神経細胞１つあたりのChronosの発現量を増加させる。光刺激ファイバーにより光刺激のエネルギーが十分に蝸牛神経に到達できていなかった可能性を考え、高出力の光刺激装置により再度蝸牛神経の活動をモニターする方法を考案し、実行する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
内因性ニューロンのAAV遺伝子導入条件の設定に手間取っておりin vivoリプログラミングに予定していた動物、試薬等をまだ購入していないため。
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