| 研究課題/領域番号 |
19K18894
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| 研究機関 | 聖マリアンナ医科大学 |
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研究代表者 |
佐瀬 佳奈 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (30821904)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | オートファジー / ｐ62 / ｐ38 |
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| 研究実績の概要 |
オートファジーの活性が視神経に保護的な作用があることをこれまでの研究で示しており、現在はオートファジーの上流にあると考えられ、多くの神経変性疾患で神経障害的に働くと報告のあるMAPKp38が視神経に及ぼす影響と、オートファジーへの関与を明らかにする目的で研究を遂行している。
緑内障への関与が指摘されているTNFを用いたTNF誘発視神経障害モデルにおいてオートファジー誘導体として知られ、神経細胞に保護的な作用を示したと報告のあるAkebia Saponin D(ASD)が軸索障害を有意に抑制することを確認した。またオートファジーフラックスの指標であるｐ62の発現がTNFモデルで上昇するが(p62の発現上昇はオートファジーフラックスの停滞を意味する)、ASDはその上昇を抑制することを確認した。つまり視神経においてTNFによって障害されたオートファジーフラックスがASDにより改善することを意味している。これらの結果は、TNF誘発視神経障害モデルにおけるASDによる軸索保護作用にもオートファジーフラックスの活性化が関与している可能性を示唆している。また、神経変性疾患において、活性化することで神経障害性に働くと報告があるp38についての検討もおこなった。視神経のウェスタンブロットでTNFモデルではp-p38の発現上昇を認めるが、これもASDにより抑制される事が確認できている。さらに、視神経におけるp-p38の局在についてはこれまで評価されていないが、今回免疫染色にて網膜神経節細胞だけでなく神経線維にも局在していることが確認できた。
p38がオートファジーの上流にあり、オートファジーフラックスを制御しているのであればp38を抑制することで視神経軸索数やオートファジー関連因子に何らかの影響を及ぼすと考えられ、それについて現在検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
既に先行実験で、TNF誘発視神経障害モデルに対するASDによる軸索保護効果は確認している。ウェスタンブロットではオートファジーフラックスのマーカーであるp62とオートファジーの上流にあると考えているp-p38の発現を検討し、p62、p-p38ともにTNFにより発現が上昇しその発現上昇をASDが抑制した。これらの結果からASDによる軸索保護作用にはオートファジーフラックスの改善が関与し、さらにp-p38はオートファジーフラックスに何らかの影響を与えている可能性があると考えられた。そこで、新たにp-p38の視神経での局在を免疫染色で評価した。p-p38は網膜神経節細胞だけでなく神経線維にも局在していることが確認できた。次に、p38を抑制することで視神経軸索数に影響を及ぼすかを評価した。p38のinhibitorであるSB203580をTNFと同時に硝子体注射しTNF単独硝子体注射群の軸索数と比較検討した。TNF単独硝子体注射群で有意に認められた軸索数の減少をTNF+SB203580硝子体注射群では保護する傾向にあった。
p38阻害剤がTNF誘発視神経障害モデルにおいて視神経軸索保護作用を示す結果となり、p38がオートファジーフラックスに何らかの影響を与えていると考える一つの根拠となった。
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| 今後の研究の推進方策 |
p38阻害剤がTNF誘発視神経障害モデルに対し保護的に働くことを確認した。p38とオートファジーの関係を明らかにするためにウエスタンブロットでオートファジーのマーカーであるLC3やオートファジーフラックスのマーカーであるp62の発現をcontrol群、TNF単独硝子体注射群、TNF+SB203580硝子体注射群で比較する。さらにSB203580投与群ではLC3とneurofilamentの免疫染色を行い、軸索内のLC3のimmunopositive dotsの評価を行う。さらに各群での軸索内、軸索外でのオートファゴソームの定量を電子顕微鏡所見にて検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
以前から研究室で使用し保管されていた抗体や試薬を用いたため、今年度は研究費を削減できた。
次年度は新規の抗体を使用し研究する計画の為、購入費用が必要と考える。
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