| 研究課題/領域番号 |
19K18945
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
園田 聡一朗 九州大学, 歯学研究院, 助教 (10831985)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 乳歯幹細胞 / 胆道閉鎖症 / 肝細胞 / 胆道上皮細胞 |
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| 研究実績の概要 |
1. 胆道閉鎖症患者由来乳歯幹細胞(BA-SHED)のHNF6に関するエピジェネティック解析：BA-SHEDにおけるHNF6の発現上昇の機序を解明するために、先行研究に加えてHNF6転写開始点近傍領域における複数箇所のクロマチンアクセシビリティー解析を実施した。健常児由来乳歯幹細胞（健常SHED）と比較して、BA-SHEDのHNF6転写開始点近傍においてクロマチンアクセシビリティーの上昇を認めた。この結果を元にHNF6転写開始点近傍のHistone修飾解析、RNA polymerase II局在解析を行った。 Histone修飾に有意な差は認められなかったが、BA-SHEDにおいて転写開始点近傍でのRNA polymerase IIの局在上昇が認められた。
2. in vitroでの肝細胞・胆道上皮細胞への分化・解析：先行研究にて、四塩化炭素誘導型肝線維症モデルマウスへの移植実験により、健常SHEDと比較してBA-SHEDの移植治療効果が低下しているという結果を得た。BA-SHEDの治療効果低下の機序を明らかにするために、in vitroにて肝細胞分化解析ならびに胆道上皮細胞分化解析を行った。BA-SHEDは健常SHEDと同等の肝分化能を示した。また先行研究で得られた胆道上皮細胞分化培養系をタンパク質局在解析による比較に適した系にするため、培養系の改善を進めた。
3. BA-SHEDの組織再生能力改善：BA-SHEDの移植治療における組織再生能力低下の機序解析のため、HNF6発現が組織再生能力に及ぼす影響をHNF6の発現抑制（siRNA）を用いて解析した。TGFBR2はHNF6により発現が抑制されることが報告されており、肝組織発生において重要な役割を果たすことが知られている。本解析により、BA-SHEDのHNF6の発現抑制によりTGFBR2発現が回復することを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. 胆道閉鎖症患者由来乳歯幹細胞(BA-SHED)のHNF6に関するエピジェネティック解析：1) HNF転写開始点近傍のクロマチンアクセシビリティー解析（Nuclease処理とqPCR法）を先行研究に加えて複数箇所に対して実施し、健常SHEDと比較してBA-SHEDの転写開始点近傍でクロマチンアクセシビリティーの上昇が認められた。2) HNF6転写開始点近傍のHistone修飾解析（ChIP-qPCR法）では１）の結果を元に同領域のHistone修飾状態(H3K4me、H3K27ac、H3K27me) を解析した。当初の計画に加えてRNA polymerase IIの結合をChIP-qPCR法で解析した。Histone修飾に有意な差は認められなかったが、BA-SHEDにおいて転写開始点近傍でのRNA polymerase IIの局在上昇が認められた。
2. in vitroでの肝細胞・胆道上皮細胞への分化・解析：2D培養による肝細胞分化誘導解析により、BA-SHEDは健常SHEDと同等の肝分化能を示した。一方、先行研究で健常SHEDにおいて確立した3D培養による胆管上皮細胞分化誘導では、色素取り込み能を示す管状構造の形成がみられたが、技術的にタンパク質局在解析が難しく、胆道上皮細胞への分化能の評価は完了しなかった。胆管上皮細胞分化誘導系の改善を継続している。
3. BA-SHEDの組織再生能力改善：BA-SHEDにおいて、siRNAによるHNF6の発現抑制を行った。健常SHEDと比較してBA-SHEDでは肝組織発生に重要な役割を果たすことが知られているTGFBR2の発現が低下しており、HNF6の発現抑制によりTGFBR2発現が回復することを明らかにした。
以上の経過から、本研究は概ね順調に進捗していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
胆道上皮細胞分化能の解析は、BA-SHEDの移植治療効果を評価する上で不可欠である。従って、今年度も引き続き分化培養系の改善に取り組む。適当な分化培養系の確立が困難である場合を想定し、並行して移植実験におけるSHEDおよびBA-SHEDの生体内での細胞分化動態をより詳細に解析する。具体的には下記の計画で研究を遂行する。
1. in vitroでの肝細胞・胆道上皮細胞への分化・解析：
1) 胆管上皮細胞分化：MatrigelおよびCollagen type Iを用いた3D cultureによる分化誘導；a. 胆管上皮細胞マーカー遺伝子の発現解析（qRT-PCR）、b. 胆管上皮細胞分化マーカーの発現解析（免疫蛍光染色）：CK7、CK19、Alpha-tublin、c. 胆管上皮細胞機能解析：Cholyl-lysyl-fluoresceinによるビリルビン輸送能解析
2. BA-SHEDの組織再生能力改善：1) BA-SHEDにおけるHNF6の発現抑制（siRNA・CRISPR-Cas9システム）を行い、 肝細胞分化・胆管上皮細胞分化の評価を行う。2) 移植実験；1)の細胞を用いた四塩化炭素誘導型肝線維症モデルマウスへの投与実験と治療効果評価；a. 血清学的解析（生化学的解析・ELISA）: AST、ALT、ALB、b. 組織学的解析：H&E染色、トリクローム染色、免疫染色（HLA-ABC、ACTA2、CK19、SOX9）、c. 胆汁排泄機能解析；色素注入法、糞便内ビリルビン量測定、d. Flow cytometryによる定量的マーカー発現解析。
3. 健常SHEDを用いたBA-SHEDの変異再現：1) CRISPR-dCas9システムを用いて恒常的なHNF6発現亢進を再現し、肝細胞分化および胆道上皮細胞の解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
3月に予定していた再生医療学会学術大会発表がCOVID-19感染拡大防止の観点から中止され、旅費が不要となった。急遽未使用経費が生じたが、時期の都合上、全額を必要物品の購入に振り返ることができず、次年度使用額が生じた。
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