| 研究課題/領域番号 |
19K19029
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
西藤 法子 広島大学, 病院(歯), 助教 (40735099)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| キーワード | 歯学 / Semaphorin7A / 歯髄細胞 / 細胞生存能 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、歯の細菌感染や機械的刺激によって歯髄に生じた不可逆的な炎症を制御することで、歯の神経を取り除く抜髄を行うことなく歯髄を回復させ、保存するための新たな治療方法の確立を目指している。神経細胞の神経軸索ガイダンス因子として同定され、セマドメインを有するSemaphorin7A（Sema7A）は骨代謝、癌の形成、免疫などで関与が報告されており、歯の構成組織の１つである象牙芽細胞での発現が確認されている。また、Sema7Aが炎症促進に関与しているとの報告から、歯髄の不可逆性の炎症の増悪因子の一つとしてSema7Aが関与している可能性を考えた。
Sema7Aはリコンビナントタンパクを使用し、抜去歯牙から採取したヒトの歯髄線維芽細胞に対して、炎症性サイトカインの１つであるTNF-αで誘発した炎症惹起下での反応を検討した。歯髄線維芽細胞にはTNF-αの受容体とSema7Aの発現をWestern Blotting法で確認した。TNF-αとSema7Aで刺激した歯髄線維芽細胞の培養上清中からは検出されたIL-6とIL-8は、TNF-α単独で刺激した時よりも分泌量が増加傾向を示すことをELISA法で確認した。また、TNF-αとSema7Aで刺激した歯髄線維芽細胞にIκB/IKK阻害剤、MEK阻害剤、p38 MAPK阻害剤を作用させた結果、IL-6、IL-8の分泌量が減少したが、JNK阻害剤では分泌量に変化は認められなかった。Western Blotting法で細胞内タンパクを検討すると、TNF-α単独刺激よりもIκB-αの分解が促進され、ERKのリン酸化を促進する傾向を確認した。
これらの結果から、歯髄線維芽細胞の炎症時にSema7Aは炎症促進因子として機能する可能性は示唆されたが、明確な再現性はまだ得られておらず、十分な検討が必要であると考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
コロナウイルスによる研究の制限と研究室の移転、体調不良などため進行が遅れた。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後のin vitroの実験系では、これまでの実験で使用していた治療のため便宜的に抜歯した歯牙から採取した歯髄由来の細胞（E-133）を歯髄線維芽細胞に加えて、反応に個人差もあることを考慮し市販されている歯髄繊維芽細胞も用いる。歯髄線維芽細胞におけるSema7Aの受容体（Integrin β1、Plexin C1）とSema7A、TNF-α受容体をWestern Blotting法で確認し、炎症シグナルであるNF-κB、MAPK、JAK/STST経路の細胞内シグナル伝達経路についての解析を行う。炎症反応時の歯髄線維芽細胞におけるSema7Aの機能を検討するため、歯髄細胞の炎症誘導因子としてTNF-αとIL-1βを用いる。刺激後24時間培養した細胞の培養上清中に含まれる炎症性サイトカイン（IL-6,IL-8）およびケモカイン（CCL20）の量をELISA法で測定する。また歯髄線維芽細胞におけるSema7A受容体の探索として各特異抗体を用いて行い、さらに中和抗体を作用させることでSema7Aによる歯髄線維芽細胞から炎症性サイトカインの発現が抑制されるかを検討する。
In vivoの実験系ではラットの実験的露髄モデルを用いて、象牙芽細胞層と歯髄組織中のSema7A発現変化について抗Sema7A抗体を用いて確認する。無切削歯、露髄と伴わない切削歯をコントロール群とし、Sema7Aの発現状態と組織形態を比較する。さらにSema7Aの機能阻害として、in vitroの実験で用いたSema7Aの受容体に対する中和抗体を含浸させたスポンジを露髄面においたラットの臼歯露髄モデルによって検討する。
最終年度では得られた実験結果を学会で発表し、論文にまとめる予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度に助成金が生じた理由は、コロナウイルスによる研究の制限と研究室の移転のため、実験の進行に支障があったことに加えて、体調不良により予定よりも実験が進まなかったためである。
復職後にこれまでのin vitroの実験系に加えて、遅延しているin vivoの実験系を進めたい。これまでの実験結果から、着目するin vitroの実験系は要点を絞って行い、最終年度としてまとめられるように計画している。In vivoの実験系は同じ研究室で以前マウスの露髄モデルを作製したことのある者に教授してもらいつつ進めることで、実験を推進させたいと考えている。
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