| 研究課題/領域番号 |
19K19174
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| 研究機関 | 明海大学 |
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研究代表者 |
坂下 英 明海大学, 歯学部, 助教 (20823181)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | メッケル軟骨 / セプトクラスト / E-FABP/FABP5 / マウス |
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| 研究実績の概要 |
マウスメッケル軟骨の吸収面に存在するE-FABP陽性細胞はcathepsinB抗体との二重染色により共局在が認められたことから、同細胞はセプイトクラストと同定された。したがって、メッケル軟骨の吸収面にもセプトクラストが存在し、未石灰化軟骨基質にその突起を伸展していることから、未石灰化軟骨基質の吸収に関与していると考えられた。軟骨組織吸収に関与する他の細胞（破軟骨細胞・マクロファージ）との位置関係を解析したところ、セプトクラストは軟骨吸収面の直近に局在していた。また、血管内皮細胞をendomucin抗体を用いた二重染色により、セプトクラストは毛細血管に隣接していることがわかった。さらに骨端板のセプトクラストはpericyte（血管周皮細胞）由来であると報告されたため、pericyteのマーカーであるPDGFRβ抗体を用いて二重染色したところ、E-FABP陽性セプトクラストの細胞膜との共局在を認めたので、メッケルのセプトクラストもpericyte 由来であることが示唆された。
セプトクラストの数と3次元的な形態を共焦点レーザー顕微鏡で解析したところ、軟骨吸収の最も活性の高いE16、17が最も細胞数が多く、吸収後期のE18では少なくなっていた。3次元的形態では E16、17では突起を有した紡錘形細胞であったが、E18では突起の数、細胞の形態がやや球形の細胞が観察された。
器官培養では現在E10、12マウス胎児の第一鰓弓を用いて器官培養を行なった。E10では10日間培養しメッケル軟骨の培養は可能であるが組織の発育・形態に多少のばらつきが認められたため、現在条件検討を行なっている。E12の器官培養では培養組織が大きくE10よりのさらに器官培養が困難であり一部組織に壊死がみとめられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
免疫組織化学染色：既存のE15,16,17,18のddYマウス胎仔組織を用いたマウスメッケル軟骨の吸収面における免疫組織化学的解析は行っているが、以下の理由により研究にやや遅延が認められている。
凍結連続切片での薄切切片の作成の際、軟骨組織と結合組織の間及び、石灰化軟骨基質と未石灰化軟骨基質の境界で組織の裂開が認められやすい。本研究では連続薄切切片の作成が必要であり、解析目的とする細胞がこのような境界部に存在するため、吸収面の解析で使用できる切片の作成には想定よりも多くの組織ブロックを準備する必要があり、時間がかかっている。
器官培養：E10、E12のマウス胎児の第一鰓弓を用いて研究を行なっているが、以下の理由で本研究の課題が遅れていると考えられる。
E10の器官培養：現在n数を増やしているが、培養された下顎の形態とメッケル軟骨の組織形態にばらつきが多い。一度に培養する組織の数などを再検討し、形態のばらつきを少なくすることが必要であると考えられる。また、培養に用いる胎仔の成長段階のばらつきを少なくするため、さらに厳密な頭臀長の測定や体節数のカウントを厳密に行なっている。
E-12の器官培養：時間単位で第一鰓弓の大きさが異なり培養開始の時間を再度考慮する必要があること。E12の第一鰓弓はもともと組織が大きくE10の器官培養で使用している機材では培養を進めていくと壊死する組織が多く認められたため、既存の培養機材ではなく、再度培養環境を検討する必要があると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
上記遅延の理由を改善するために
１）マウス胎児を摘出後の脱血方法、固定時間、方法を再検討し、軟骨吸収面での切片の裂開を防ぐ方策を講じる。さらに凍結切片では6μmでの切片作成が限界であり、今後パラフィン包埋を用いて4μm以下の薄切切片の作成を試みる。
２）軟骨吸収面に存在するセプトクラストに特異的な遺伝子を、RT-PCR、in situ hybridization法を用いて解析し、LAMP法でタンパク量を解析する。
３）器官培養ではE12マウス胎仔第一鰓弓を摘出し、計10日間培養を行ったが組織の壊死などが認められたためE10で使用した培養機材の大きさの見直しを行う。 E12の第一鰓弓はE10と比較すると1.5倍程組織が大きいためそれに伴って培養液の量・一回あたりの培養数・培養機材（ステンレスメッシュ大きさ）を培養組織のサイズに合わせて再度検討する。
培養後の組織を解析し、メッケル軟骨の吸収が開始しているか確認し、これら組織をコントロール群とし、E-FABPと結合する可能性の高いn-3 脂肪酸とレチノイン酸を培地中に投与した実験群を設定し、コントロール群と比較する。この実験系に先立って、投与するn-3系脂肪酸の種類と濃度、レチノイン酸の濃度の検討を行なっていく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ほぼ予定通りの経費であったが、胎齢10(E12)、12日齢のマウス第一鰓弓の器官培養系を行うにあたって本来の予定ではn-3系不飽和脂肪酸,レチノイン酸の投与を行いメッケル軟骨の吸収との関連を解析する予定であった。しかしE12の器官培養を進めていく中で組織の培養に苦慮しメッケル軟骨の吸収を認める組織の作成が2020年度は成功しなかった。それに伴い予定していた実験系に遅れが生じ、本年度中に予定していた物品の一部の購入を延期していた。
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