| 研究課題/領域番号 |
19K20129
|
|---|
| 研究機関 | 松本大学 |
|---|
研究代表者 |
浅野 公介 松本大学, 人間健康学部, 助手 (70508449)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| キーワード | 糖新生 / PEPCK / H4IIE 細胞 / 転写調節 / インスリン / デキサメタゾン |
|---|
| 研究実績の概要 |
肝の糖新生は、血糖の維持および上昇に重要な役割を果たし、血糖上昇ホルモンによる糖新生系酵素遺伝子の転写促進により亢進される。一方、概日リズム調節ホルモンであるメラトニンが血糖調節、特に糖新生系に与える影響については、不明な点が多い。そこで、本研究では、メラトニンが血糖上昇に関与するかを明らかにするため、肝におけるメラトニンによる糖新生系酵素遺伝子の発現調節機構を in vitro および in vivo の両面から明らかにすることを目的とした。
2019 年度の研究結果より、 H4IIE 細胞において、1) メラトニンは PEPCK 遺伝子の発現を誘導し、その誘導は遺伝子の転写レベルで生じ、またその誘導には新規タンパク質の合成を必要とすること、2) ラット PEPCK 遺伝子プロモーターの -467 ~ +69 の領域にはメラトニンに応答する正の転写調節領域が存在すること、そして 3) グルココルチコイドであるデキサメタゾンおよびメラトニンが相乗的に PEPCK 遺伝子の発現を誘導し、さらにインスリンはメラトニン存在下において PEPCK 遺伝子の発現を優位に抑制することが示された。
2020 年度は、メラトニンによる PEPCK 遺伝子の発現誘導に関わるシグナル伝達経路について、各種シグナル伝達分子阻害剤を用い検討した。その結果、phosphoinositide 3-kinase の阻害剤である wortmannin、p70S6 kinase の阻害剤である rapamycin は、PEPCK mRNA 量の増加に影響を与えなかったが、MEK/Erk 阻害剤である PD98059 がその増加を抑制した。これより、メラトニンが MAPK シグナル伝達経路を介して PEPCK 遺伝子の発現を誘導することが示唆された。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ラット肝癌細胞株 H4IIE 細胞を用い、メラトニンが PEPCK 遺伝子の発現を誘導するかを検討した。様々な濃度、時間でメラトニン処理した結果、PEPCK mRNA 量が濃度依存的かつ経時的に増加した。次に、その発現誘導に転写および翻訳が関与するかを、各々の阻害剤を用い検討した。その結果、その誘導は両者により完全に阻害された。そして、その誘導に関わるシグナル伝達経路について、各種阻害剤を用い検討した。その結果、MEK/Erk 阻害剤である PD98059 がその誘導を抑制した。
次に、メラトニンにより PEPCK 遺伝子の転写が促進されるかを、レポーターアッセイにより検討した。その結果、ラット PEPCK 遺伝子の -467 ~ +69 までのプロモーター領域を含むレポータープラスミドではメラトニンによりプロモーター活性が上昇した。
次に、この発現誘導がインスリンやデキサメタゾンにより調節されるかを検討した。デキサメタゾン処理した H4IIE 細胞では PEPCK mRNA が誘導され、この誘導はメラトニンでさらに促進された。これに対し、インスリン処理では、メラトニンの存在に関わらず PEPCK mRNA 量が低下した。
以上より、1) メラトニンは MAPK シグナル伝達経路を介し PEPCK 遺伝子の発現を誘導する、2) その誘導は遺伝子の転写レベルで生じ、またその誘導には新規タンパク質の合成を必要とする、3) ラット PEPCK 遺伝子プロモーターの -467 ~ +69 の領域にはメラトニンに応答する正の転写調節領域が存在する、4) デキサメタゾンおよびメラトニンが相乗的に PEPCK 遺伝子の発現を誘導し、さらにインスリンはメラトニン存在下において、その発現を優位に抑制することが示唆された。
事由項目 【g】 で当初計画が遅延となり、補助事業期間を延長した。
|
| 今後の研究の推進方策 |
・in vitro で、ラット初代培養肝細胞を、様々な濃度、時間でメラトニン処理を行い、これらの細胞における PEPCK タンパク質の発現変化をウエスタンブロット法により解析する。次に、in vitro におけるメラトニンによる発現誘導の挙動が in vivo でも同様か、そして、in vivo でメラトニンがどの濃度範囲で血糖を上昇させるかを調べる。
・メラトニンによる PEPCK 遺伝子の発現誘導が、受容体を介するのか、また、どのようなシグナル伝達物質が関与するのかを調べる。このため、シグナル分子に対する各種阻害剤や siRNA で処理した H4IIE 細胞やラット初代培養肝細胞を用いて、PEPCK 遺伝子の mRNA やタンパク質の発現をリアルタイム PCR 法やウエスタンブロット法により測定し、阻害剤や siRNA 未処理群と比較する。
・メラトニン応答配列の同定を行う。このために、様々な長さに欠失させた、もしくは点変異を与えた PEPCK 遺伝子のプロモーター断片を組み込んだコンストラクトを構築する。H4IIE 細胞にそれらを導入し、メラトニン存在下・非存在下でのプロモーター活性をデュアルルシフェラーゼアッセイにより測定・比較する。
・メラトニン応答配列を同定できた場合、ゲルシフト法や ChIP assay を行い、メラトニンに応答しその領域に結合する転写因子を同定する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度使用額が生じた理由は、補助事業期間を延長したためである。
次年度の使用計画は、物品費（設備備品費および消耗品費）として 900 千円を計画している。さらに 、マウス個体やラット初代培養肝細胞を実験系に用いるため、実験動物費として 200 千円を計画している。
情報収集のための研究打ち合わせで学会等に参加するための旅費として 100 千円、本研究の投稿論文に必要な費用として英文校正費 30 千円、ならびに投稿料、および別刷費として 270 千円を計画している。
|
