| 研究課題/領域番号 |
19K20455
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| 研究機関 | 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構 |
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研究代表者 |
工藤 健一 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 放射線医学総合研究所 放射線影響研究部, 博士研究員(任常) (00805799)
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| 研究期間 (年度) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| キーワード | オルガノイド / 放射線応答 / 乳腺 / γH2AX / DNA損傷 / 幹細胞 / 再生医療 / 放射線 |
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| 研究実績の概要 |
本課題は乳腺の放射線応答解析をするため、実験ツールとしての乳腺オルガノイド開発を目的とする。平成31年度はSprague Dawleyラットから採取した乳腺の基底細胞をコラーゲンゲル包埋培養することで乳腺オルガノイドの作成を試みた。検討の結果、先行研究で明らかにされているTerminal ductal lobular unit様構造をもつ乳腺オルガノイドの発生を確認し、パラフィン包埋切片の免疫染色から乳腺細胞マーカーの発現を確認した。オルガノイド生成率から求めた全乳腺細胞中の乳腺幹細胞割合は1-2%程度であり、乳腺再生活性試験から計算される数値と一致した。以上の内容は論文雑誌Radiation Researchから令和2年度中に出版予定である。
オルガノイドの実験材料としての用途の可能性を模索するため、作製した乳腺オルガノイドに放射線照射を行い、フローサイトメトリーによる分析を検討した。γH2AXおよび5'-Ethynyl-2'-deoxyUridine（EdU）ははDNA損傷および細胞周期への放射線影響を判断する上で重要なマーカーである。放射線照射した乳腺オルガノイドをコラーゲンゲル中から取り出し、フローサイトメトリーで分析したところ、放射線量に応じた定量解析が可能であることがわかった。
この手法をヒト乳腺に適用するため、Human Mammary Epithelial Cells（HMEC）を購入し、ラット乳腺細胞と同様にコラーゲンゲル3次元培養を行った。その結果、ラット乳腺細胞よりin vivoに近い構造をもった乳腺オルガノイドの発生が確認された。しかしサイトケラチン（CK）染色による内腔細胞の発生は確認できなかった。このことから培養液の成分や培養期間について再検討を行う必要があると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
計画書提出当初の予定では初年度は乳腺オルガノイドを発生させ、in vivoとの比較のための実験を行う予定だったが、上司の温情により予定より多くの実験時間を確保できたため、γH2AXマーカーによるフローサイトメトリー解析など次年度以降の実験にも着手できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
近年のオルガノイドはiPS細胞から胚葉を分化させ、そこから幹細胞を発生させた上で作成されている。乳腺オルガノイドでこの手法を実施するには、まず非神経性外胚葉の分化から着手する必要がある。それが不可能であると判断された場合は研究実績の概要に記した通り、HMECを用い、改良した実験条件で培養することでヒト乳腺オルガノイドを作製し、完成を目指す。
ヒトin vivoに近い形態・構造をもったオルガノイドの発生が確認できたら、これに放射線（X線）を照射し、フローサイトメトリー解析によってオルガノイド各細胞の放射線応答解析を行う。この実験によって乳腺上皮のどのような細胞にDNA損傷等が起こりやすく、乳癌につながるような反応を示すのか分析を行う所存である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
令和元年度3月に予定されていた第19回再生医療学会総会（横浜開催）がコロナ禍により延期となり、登録料と旅費等が使用額から差し引かれたことにより、次年度使用額（B-A)は報告書に示す通りとなった。
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