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本研究では分子状窒素をアンモニアへと還元する酵素ニトロゲナーゼを高等植物に導入し、窒素固定可能な作物植物を創り出す基盤を作ることを目指した。ニトロゲナーゼの還元コンポーネントであるNifHの発現を指標に植物体内における最適なニトロゲナーゼの発現部位の探索を行った。昨年までの研究により、植物細胞における葉緑体、ミトコンドリア、細胞質において局在的にNifHを発現させることに成功し、花茎において最もNifHの発現量が高くなることが明らかとなった。本年度は植物細胞内で発現したNifHについて、その活性を検出するためその精製手法の確立と、in vitroでの活性測定方法の構築を行った。植物組織からNifHを精製するため発現確認のために作成したFLAGタグを融合したNifH発現株以外に、HisタグやGSTタグをNifHのN末端に融合したNifH発現株を作成した。先行して作成されたFLAG-NIfHを発現する発現株から、FLAG-NIfHを抽出し精製する実験を行った。FLAG-NifHの精製は確認されたが、活性測定に用いる量には不十分であり、さらなる抽出条件の検討が望まれる。また抽出したFLAG-NifHの活性を検出するためシアノバクテリアを用いてNifDKタンパク質を調製し、in vitroでニトロゲナーゼの活性を再構成する実験系を構築した。その実験系を用いてNifHの検出限界濃度を算出し、その検出限界濃度以上のFLAG-NifHを植物体から調製し、その活性の評価を行う。本研究では植物体内で発現したNifHの活性の確認はできなかったが、時間的、空間的に分離したサンプリングによって、植物組織内でNIfHの安定性について新たな知見をもたらし、今後の植物体におけるニトロゲナーゼ発現に関する研究の礎となる実績となった。
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