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本研究は、細胞内で翻訳が安定に停止する「翻訳停止配列」を利用し、それを部位特異的in vivo光架橋法と組み合わせることで、生細胞内で翻訳の各ステップでの翻訳途上ポリペプチド鎖のダイナミックなフォールディング・相互作用動態を解析可能な生化学的手法の構築を目指すものである。
これを達成するために、細胞内でより安定に翻訳途上ポリペプチド鎖を蓄積可能で翻訳途上鎖を検出可能な「翻訳停止カセット配列」の構築を行った。以前の研究から最も短く、翻訳停止効率が良いと報告されているMannheimia succiniciproducens由来のSecM翻訳停止配列を鋳型に、その上流にHAタグ下流にSPAタグ配列を付加することで、翻訳途上鎖を安定に蓄積すると共に翻訳停止効率を評価できるカセット配列を構築した。この翻訳停止カセットを用いて、モデル基質の系統的な翻訳途上鎖を細胞内で発現させたところ、いくつかの翻訳途上鎖は安定に存在せず、直ぐに翻訳停止が解除されてしまうことを見出した。
そこで、翻訳停止配列を付加した翻訳途上鎖の相互作用動態を部位特異的in vivo光架橋法を用いて解析可能かを検証するために、翻訳停止配列を有する、細胞のタンパク質膜透過能モニターポリペプチド鎖であるVemPを対象に系統的なin vivo光架橋解析を行った。その結果、リボソームタンパク質やSecY等のVemPと相互作用すると予測された因子に加え、未知の因子との架橋を検出した。さらに、パルスチェイス法とin vivo光架橋法を組み合わせたPiXie法によって、それらの因子とVemPの相互作用のタイミングを検討し、翻訳停止配列をもつ翻訳途上鎖の相互作用動態をin vivo光架橋解析を用いて解析できることを実証した。
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