2019 年度実施状況報告書

ゲノム編集による5´非翻訳領域の改変によりタンパク質発現量を増加させる技術の開発

研究課題

研究課題/領域番号	19K22299
研究機関	北海道大学
研究代表者	尾之内均北海道大学, 農学研究院, 准教授 (50322839)
研究期間 (年度)	2019-06-28 – 2022-03-31
キーワード	ゲノム編集 / 5′ 非翻訳領域
研究実績の概要	近年、ゲノム編集技術が作物の品種改良に活用されるようになってきている。しかし、遺伝子組換えにあたらない範囲でのゲノム編集技術の作物育種への利用はほとんど遺伝子破壊に限られており、転写や翻訳を抑制する配列が同定されている一部の遺伝子以外は、外来導入DNAを残さずに特定のタンパク質の発現量を増加させることは現状では困難である。そこで本研究では、より多くの作物遺伝子において遺伝子組換えに該当せずにタンパク質の発現量を増加させることを可能にするために、mRNAの翻訳効率に影響を与える5´非翻訳領域配列をゲノム編集を用いて改変することでタンパク質発現量を増加させる方法の開発を目指す。今年度は、イネとトマトの遺伝子の中から、発現量を増加させることで有用な形質を作物に付与できると考えられるものを選び、5´非翻訳領域に欠失変異を導入することによって翻訳効率を高めることができるかを一過的発現解析を用いて検討した。その結果、5´非翻訳領域に導入した欠失変異によって翻訳効率が上昇した遺伝子が、イネとトマトからそれぞれいくつか見出された。イネとトマトの内在性遺伝子の5´非翻訳領域に同様の変異を導入することにより、それらの遺伝子にコードされるタンパク質の発現量を増加させることが期待できる。CRISPR/CAS9システムを用いて内在性遺伝子にそのような変異を導入するためのガイドRNA配列を設計し、それらのガイドRNA とCAS9を発現させるためのゲノム編集用コンストラクトをイネとトマトに導入した。これまでに作出したイネとトマトの形質転換体の一部の系統について、Heteroduplex Mobility Assay (HMA)とシークエンス解析によって変異を検出し、一部の遺伝子の5´非翻訳領域に期待通りの変異が導入された個体を得た。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由今年度は、イネとトマトの遺伝子の中から、5´非翻訳領域への変異導入によりタンパク質発現量を増加させることができる遺伝子を一過的発現解析によって選抜し、内在性遺伝子の5´非翻訳領域に変異を導入するためのゲノム編集用コンストラクトを導入した形質転換イネと形質転換トマトを作出する予定であった。それらの計画はおおむね達成され、さらに一部の遺伝子については5´非翻訳領域に期待通りの変異が導入された個体を得ることができた。したがって、研究がおおむね順調に進展していると言える。
今後の研究の推進方策	前年度の研究により、CRISPR/CAS9システムを用いて5´非翻訳領域に変異を導入する標的遺伝子の一部については、すでに期待通りの変異が導入された系統を得ることができた。それらのイネとトマトの系統については、今後、次世代の個体の中から変異をホモ接合体として持ちゲノム編集用コンストラクトを持たない個体を選抜する。そのようなゲノム編集用コンストラクトが除かれた変異ホモ系統を確立し、標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現量がそれらの系統において増加しているかをウエスタン解析によって調べる。特定の細胞でしか発現していない等の理由でウエスタン解析による検出が困難な場合は、変異が導入された5´非翻訳領域をクローニングしてルシフェラーゼ遺伝子につなぎ、一過的発現解析により変異のタンパク質発現量への影響を検討する。5´非翻訳領域の変異により目的タンパク質の発現量の増加が見られた系統を用いて、期待される形質や表現型がみられるかを解析する。イネとトマトの標的遺伝子の中で、5´非翻訳領域の変異の検出をまだ行っていない遺伝子については、ゲノム編集用コンストラクトが導入された形質転換体の中から、Heteroduplex Mobility Assay (HMA)とシークエンス解析によって5´非翻訳領域に期待通りの変異が導入された個体を探索する。5´非翻訳領域に変異が検出された系統については、前年度に同定された変異系統と同様に、ゲノム編集用コンストラクトが除かれた変異ホモ系統を確立する。標的遺伝子にコードされるタンパク質の発現量がそれらの系統において増加しているかをウエスタン解析または一過的発現解析によって調べ、目的タンパク質の発現量の増加が見られた系統を用いて形質や表現型の解析を行う。