| 研究課題/領域番号 |
19K22311
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
宗 知紀 九州大学, 農学研究院, 助教 (90221340)
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| 研究分担者 |
山内 伸彦 九州大学, 農学研究院, 准教授 (00363325)
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| 研究期間 (年度) |
2019-06-28 – 2023-03-31
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| キーワード | フィルター法 / 除核法 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は小型野生ネコ保全の手段としての体細胞クローン作製技術を開発するため、その基礎的情報を収集することを目的としている。体細胞クローン作製にはドナーとなる体細胞とレシピエントとなる成熟卵母細胞が必要となる。しかし小型野生ネコから体細胞を採取するためには非侵襲的であることが絶対的な条件である。そこで本研究では、近縁種であるイエネコをモデルとし、動物病院などで避妊手術を行うときに得られる糞と雌猫の廃棄卵巣から、ドナー細胞とレシピエント細胞を得ることを検討した。
本年度の研究成果：
【ドナー細胞採取】糞表面をPBS/PVAで洗い流し、得られた懸濁液を遠心分離すると、沈殿物に生きた細胞が存在していることを確認したが、より多くのドナー細胞を採取するため、排せつ直後の糞をPBS/PVA中で緩やかに撹拌し、荒い濾紙でろ過したのち、遠心分離した。沈殿物を再懸濁したのち濃度勾配法あるいは2重フィルター法で細胞を分離した結果、2重フィルター法がはるかに効率が良いことが分かった。
【レシピエント卵母細胞除核】細胞質の色が黒くかつサイズも大きい卵母細胞を選び、正常に成熟した卵丘卵母複合体より卵丘細胞を除去し、第二減数分裂中期（MⅡ期）まで到達した卵母細胞に単為発生処理を行った。単為発生処理（卵子活性化）は電気刺激法をもちいた。除核についてはデメコロシン処理によって第二減数分裂後の核が第二極体とともに細胞膜から突出するので、容易に行えることが確認された。コロナ禍によりネコの卵巣提供が激減しているため、購入可能なウシ卵巣を代用して、マニュピレータによる除核の手技の習得に励んでいる。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
2019年度から本研究を開始し、小型野生ネコのモデルとしてイエネコを用い、動物病院で避妊手術の際に得られる糞と廃棄される卵巣を利用して、ドナー細胞とレシピエント卵母細胞が得られる効能性が示された。糞表面に腸粘膜から剥がれ落ちたと思われる生きた体細胞が付着していることが明らかになった。また卵巣から卵丘卵子複合体がたくさん得られるが、幼若な個体と成体では卵母細胞の細胞質が異なっていることが明らかとなり、レシピエント卵母細胞を選抜する指標が示された。その結果、卵母細胞の成熟率が向上した。またデメコロシン処理によって除核が容易になった。しかしコロナ禍の影響で、動物病院から得られる廃棄卵巣や糞が前年より減少し、除核のためのマニピュレーター操作まで卵母細胞を供給することが困難であったが、現在は購入可能なウシ卵巣を代用して、技術を向上させつつある。
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| 今後の研究の推進方策 |
ドナー細胞：糞からフィルター法により採取された細胞核DNAの正常性を検討する。また、微生物の汚染対策も検討する。
レシピエント卵母細胞：ネコの卵巣の提供が激減したため、ウシ卵子を用い、除核のためのマニピュレーター操作技術を向上させる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
コロナ禍のため、ネコ卵巣の提供が激減し、半年ほど実験が滞っていた。予定した予算を使い切れなかったため、期間延長を申請した。次年度はネコ卵巣及び尿の代用としてウシを使えるため、予算を使い切る予定である。
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